高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)NF-κB而α-硫辛酸有抑制作用.pdf

1、目的1．觀察高糖對內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB表達(dá)、總SOD活性及MDA含量的影響；2．探討恢復(fù)正常糖和加用α-硫辛酸后，上述指標(biāo)的變化。 方法: 1．取正常新生兒臍帶進(jìn)行HUVECs原代培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)觀察和免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞鑒定； 2．將培養(yǎng)成功的HUVECs在正常糖（5．5mmol/L D-葡萄糖），高糖（11．0 mmol/L、25．0mmol/L、33．0 mmol/L D-葡萄糖）下培養(yǎng)5天，相差顯微鏡下觀察，

2、以選取適當(dāng)?shù)母咛歉深A(yù)濃度； 3．取第3代對數(shù)生長期HUVECs進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)試劑分別是正常糖（N）5．5mmol/L，高糖（H）25．0mmol/l，α-硫辛酸（α）0．1mmol/L。 第一部分：觀察高糖對HUVECs的影響，分2組：N組、H組，干預(yù)72h后，檢測NF-κB表達(dá)量、總SOD活性及MDA含量。第二部分：觀察不同時間高糖對HUVECs的影響，分2組：H24h組、H72h組，分別干預(yù)24h/72h后，檢測指標(biāo)

3、。第三部分：觀察高糖或同時給予α-硫辛酸對HUVECs的影響，分3組：N組、H組、Hα組，24小時后進(jìn)行指標(biāo)檢測。第四部分：觀察高糖干預(yù)72h后轉(zhuǎn)至正常糖或同時給予α-硫辛酸對HUVECs的影響，分3組：N-N組、H-N組、H-Nα組，24小時后進(jìn)行指標(biāo)檢測。第五部分：觀察高糖環(huán)境干預(yù)72h后轉(zhuǎn)至正常糖不同時間對HUVECs的影響，分7組：N-N24h組、H組、H-N24h組、H-N48h組、H-N72h組、H-N96h組、H-N120

4、h組，分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h后進(jìn)行指標(biāo)檢測。采用共聚焦顯微鏡下觀察熒光分布；免疫熒光細(xì)胞技術(shù)檢測NF-κB，圖像分析軟件定量分析其表達(dá)量；分光光度法檢測并計(jì)算出總SOD活性、MDA含量。 結(jié)果: 1．原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞在接種后約1h開始貼壁生長，5～7d融合成單層。光鏡下內(nèi)皮細(xì)胞呈鋪路石狀鑲嵌排列。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，見Ⅷ因子抗原在胞漿呈顆粒狀表達(dá)。 2．葡萄糖濃度為25．0mmol/L為

5、最佳干預(yù)濃度。 3．第一部分：H組細(xì)胞胞漿及胞核均有綠色熒光，而N組僅胞漿中有少量綠色熒光。NF-κB表達(dá)量H組顯著高于N組；總SOD活性H組顯著低于N組；MDA含量H組顯著高于N組。 第二部分：H72h組細(xì)胞胞漿及胞核均有綠色熒光，而H24h組僅胞漿中有少量綠色熒光。NF-κB表達(dá)量H72h組顯著高于H24h組；總SOD活性H72h組顯著低于H24h組；MDA含量H72h組顯著高于H24h組。 第三部分：N組、

6、H組和Hα組均只胞漿有綠色熒光。三組NF-κB表達(dá)量、總SOD活性和MDA含量無顯著性差異。 第四部分：H-N組細(xì)胞胞漿及胞核均有綠色熒光，而N-N組、H-Nα組僅胞漿有綠色熒光。H-Nα組NF-κB表達(dá)量、總SOD活性與N-N組比較無顯著性差異；NF-κB表達(dá)量H-N組顯著高于N-N組；總SOD活性H-N組顯著低于N-N組；MDA含量H-N組顯著高于N-N組。 第五部分：從H組至H-N120h組，胞核綠色熒光逐漸減少：

7、N-N24h組、H-N96h組、H-N120h組主要是胞漿有綠色熒光。H-N96h組、H-N120h組總SOD活性、MDA含量與N-N24h組比較無顯著差異；N-N24h組、H-N120h組總SOD活性顯著高于H組，MDA含量顯著低于H組。 結(jié)論: 1．高糖環(huán)境能誘導(dǎo)HUVECs NF-κB表達(dá)、降低總SOD活性及增加MDA含量； 2．糾正高糖并加用α-硫辛酸可以使NF-κB表達(dá)、總SOD活性及MDA含量完全恢復(fù)