NF-κB信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的： 構(gòu)建針對(duì)NF-κB p65基因的RNAi腺病毒表達(dá)載體，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制p65基因表達(dá)，為研究NF-κB信號(hào)通路提供技術(shù)工具；研究高糖尤其是波動(dòng)性高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)增殖和凋亡的作用；利用構(gòu)建的RNAi腺病毒感染HUVEC，抑制p65表達(dá)，觀察NF-κB信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法： 設(shè)

2、計(jì)合成針對(duì)NF-κBp65 mRNA序列1566位點(diǎn)的shRNA編碼序列，克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，然后通過(guò)體外同源重組構(gòu)建重組RNAi腺病毒表達(dá)載體；在HEK293A細(xì)胞中包裝并擴(kuò)增病毒，空斑實(shí)驗(yàn)法測(cè)定病毒滴度；腺病毒感染HUVEC，Western Blot法檢測(cè)構(gòu)建的RNAi腺病毒對(duì)p65表達(dá)的抑制效果；并利用RNAi腺病毒抑制p65表達(dá)，探討NF-κB信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVEC增殖和凋亡的影響。 結(jié)果： 1.成功

3、構(gòu)建了針對(duì)NF-κBp65特異的RNAi腺病毒表達(dá)載體； 2.NF-κBp65特異的RNAi腺病毒感染HUVEC后可使p65表達(dá)量明顯下降，RNAi腺病毒MOI值25～50即可以實(shí)現(xiàn)對(duì)HUVEC p65表達(dá)的有效抑制； 3.RNAi腺病毒感染HUVEC后48h開(kāi)始檢測(cè)到p65表達(dá)量下降，且隨時(shí)間延長(zhǎng)p65表達(dá)量進(jìn)一步減少，抑制效應(yīng)至少持續(xù)至感染后第六天； 4.高糖(20.5mmol/L或30.5mmol/L)，尤

4、其是波動(dòng)性高糖可以抑制HUVEC增殖，并且促進(jìn)HUVEC凋亡； 5.NF-κBp65特異腺病毒感染HUVEC，可以明顯抑制高糖刺激的NF-κBp65核蛋白轉(zhuǎn)錄，使核內(nèi)p65蛋白表達(dá)處于基礎(chǔ)水平； 6.BrdU結(jié)果分析，NF-κBp65特異腺病毒感染HUVEC可以使高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制明顯下降(P＜0.01)，與正常葡萄糖濃度(5.5 mmol/L)下的細(xì)胞增殖率相當(dāng)(P＞0.05)；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末

5、端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyltransferase mediated nick end labeling，TUNEL)及流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果均提示NF-κBp65特異腺病毒可以保護(hù)高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡；流式細(xì)胞檢測(cè)NF-κBp65特異腺病毒可以使高糖下內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率降到正常糖濃度水平(P＞0.05)，但TUNEL結(jié)果顯示無(wú)法降至正常糖濃度下的細(xì)胞凋亡率(P＜0.01)。 結(jié)論： 構(gòu)建NF-