JAK-STAT-NF-κB通路介導(dǎo)高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與炎癥反應(yīng).pdf

1、糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。近年來(lái)，隨著社會(huì)發(fā)展，經(jīng)濟(jì)條件改善，人民生活水平提高，糖尿病患病率逐年上升。糖尿病血管病變(Diabetic angiopathy，DA)是糖尿病患者最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，也是糖尿病患者失明、截肢以及死亡的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者預(yù)后和生活質(zhì)量。
　　高血糖通過(guò)直接或間接的影響引起血管內(nèi)皮功能異常，啟動(dòng)或加重糖尿病血管病變。過(guò)去關(guān)于高血糖損傷血管內(nèi)

2、皮細(xì)胞的機(jī)制主要集中于糖基化終末產(chǎn)物、多元醇通路、蛋白激酶C等，近年來(lái)，新的研究目光已逐漸轉(zhuǎn)向內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程中的各種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)通路是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一。新近研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT通路參與了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。Marrero MR等

3、人發(fā)現(xiàn)，高糖在腎小球?yàn)V過(guò)膜細(xì)胞通過(guò)激活JAK/STAT通路導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)膜細(xì)胞的增殖，從而引起糖尿病腎病。此外，有研究通過(guò)建立糖尿病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可能參與了糖尿病心肌病心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。而對(duì)于JAK/STAT通路是否參與高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的多種損傷，目前鮮有報(bào)道。
　　核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路對(duì)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等具有重要調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究顯示高

4、糖可通過(guò)激活NF-κB通路促使內(nèi)皮細(xì)胞炎癥及免疫反應(yīng)相關(guān)因子生成增多進(jìn)而推進(jìn)血管炎癥的發(fā)生發(fā)展，而血管炎癥正是糖尿病血管病變發(fā)生發(fā)展過(guò)程中一個(gè)重要的階段。已有多項(xiàng)證據(jù)表明JAK/STAT信號(hào)通路與NF-κB信號(hào)通路之間存在交互作用。Digicaylioglu M等發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞生成素(EPO)可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用，而這一過(guò)程可被JAK/STAT通路調(diào)節(jié)。那么，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中， JAK/STAT信號(hào)通路可否調(diào)節(jié)NF-κB

5、信號(hào)通路介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)還有待進(jìn)一步研究探討。
　　目的:
　　為此，本文旨在探討JAK/STAT通路在高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)損傷過(guò)程中的作用以及在這一過(guò)程中JAK/STAT通路可否調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，為深入闡明高糖損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制提供新穎的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)
　　細(xì)胞培養(yǎng)在含10％

6、FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中，加入100 U青霉素、100 mg鏈霉素，置于37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)80％后，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行消化，適度消化后加入完全培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的消化作用。將細(xì)胞吹落以形成細(xì)胞懸液。1200 r/min離心5 min，棄上清，按1∶3傳代。
　　2、實(shí)驗(yàn)分組
　　實(shí)驗(yàn)分為6組:(1)正常對(duì)照(control)組;(2)高糖(high glucose，HG)損

7、傷組;(3) AG490（JAK/STAT通路抑制劑）預(yù)處理+高糖損傷組;(4) AG490組;(5) PDTC(NF-κB通路抑制劑)預(yù)處理+高糖損傷組;(6) PDTC組。
　　3、CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞存活率
　　將HUVECs接種在96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)孔內(nèi)生長(zhǎng)至大約80％時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求給予不同處理，于每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育2h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光值，波長(zhǎng)設(shè)定為450 nm，并根據(jù)公式

8、:細(xì)胞存活率(％)=處理組OD值/對(duì)照組OD值×100％，求得細(xì)胞存活率。
　　4、Western blot法檢測(cè)JAK2、STAT3、caspase-9、eNOS和NF-κB p65的表達(dá)
　　將HUVECs接種于60 mm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80％時(shí)給予不同處理因素，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS沖洗2次，各皿加入80μl裂解液后置于4℃裂解30 min，12000 r/min離心15 min，取上清液，蛋白濃度采用BCA

9、法進(jìn)行測(cè)定。總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用5％脫脂奶粉封閉90 min后，棄封閉液，分別加入p-JAK2和JAK2(1∶2000)，p-STAT3、STAT3和caspase-9(1∶5000),NF-κB p65、p-NF-κB p65、eNOS(1∶1000),4℃過(guò)夜，然后用TBST洗3次（每次10 min），加入Ⅱ抗(1∶10000)，室溫孵育60 min，再次用TBST洗3次（每次10 min）。EC

10、L發(fā)光液將PVDF膜顯色，暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。
　　5、雙氯熒光素(DCFH-DA)染色熒光顯微鏡攝片測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量
　　將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80％時(shí)，給予各實(shí)驗(yàn)組不同處理因素后，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，將HUVECs與10μmol/L DCFH-DA于37℃孵育30 min，再次用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，采用Image J1.41軟

11、件分析各視野平均綠色熒光強(qiáng)度。
　　6、羅丹明123染色熒光顯微鏡攝片測(cè)定細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrialmembrane potential, MMP)
　　將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至大約80％時(shí)，給予各實(shí)驗(yàn)組不同的處理因素，棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，將HUVECs與10μg/LRh123于37℃避光孵育45 min，再次用PBS洗3次。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片。用Ima

12、ge J1.41軟件分析各視野平均熒光強(qiáng)度。
　　7、ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平
　　采用抗體夾心ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平。將HUVECs接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞在培養(yǎng)孔內(nèi)生長(zhǎng)至大約80％時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)要求給予不同處理。取100μL培養(yǎng)基加入預(yù)先用IL-1β、IL-6、TNF-α抗體包被的酶標(biāo)板中，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書標(biāo)明的步驟進(jìn)行操作，最后

13、用酶標(biāo)儀記錄450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。
　　8、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來(lái)表示，使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SNK-q檢驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)組組間比較）及Dunnett-t檢驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
　　結(jié)果:
　　1、高糖上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的磷酸化(p) JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)
　　使用高糖(40 mmol/L，H

14、G)處理HUVECs6～12 h可顯著上調(diào)p-JAK2蛋白水平（P＜0.05或P＜0.01），其中在9h時(shí)，p-JAK2表達(dá)達(dá)到最高峰;應(yīng)用高糖處理HUVECs6～12 h可顯著上調(diào)p-STAT3表達(dá)(P＜0.01)，并且在12h時(shí)p-STAT3表達(dá)水平最高。
　　2、JAK/STAT通路介導(dǎo)高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性
　　高糖(40 mmol/L)處理HUVECs24 h可產(chǎn)生細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率降低至（68.

15、6±2.4）％。在高糖處理細(xì)胞前，分別應(yīng)用5、10、20、40、80μmol/L AG490（為JAK/STAT通路的抑制劑）預(yù)處理HUVECs1 h，其中10、20、40、80μmol/LAG490均能明顯抑制高糖引起的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率顯著升高;而單獨(dú)應(yīng)用80μmol/L AG490處理細(xì)胞則對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響。
　　3、JAK/STAT通路介導(dǎo)高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡
　　分別用不同葡萄糖糖濃度（10、

16、20和40 mmol/L）處理HUVECs24 h，隨著葡萄糖濃度升高，caspase-9（為反映細(xì)胞凋亡的指標(biāo)）的表達(dá)水平也逐漸升高，與對(duì)照組相比，各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。其中濃度為40 mmol/L時(shí)，caspase-9的表達(dá)水平最高。同時(shí)，用40 mmol/L葡萄糖分別處理HUVECs6～24h均能明顯增加的caspase-9的表達(dá)水平（P＜0.01），其中12h的表達(dá)水平達(dá)最高峰。但是，在HG作用細(xì)胞前

17、，用10μmol/L AG490預(yù)處理HUVECs1 h能明顯抑制HG處理12h對(duì)caspase-9的上調(diào)作用，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05）。而10μmol/L AG490本身對(duì)caspase-9的基礎(chǔ)表達(dá)水平無(wú)明顯影響。
　　4、JAK/STAT通路介導(dǎo)高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激
　　HG作用于HUVECs24 h可使胞內(nèi)雙氯熒光素(DCFH)的平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescen