外源性硫化氫通過調控瘦素-瘦素受體-JAK-STAT通路抑制高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一章 外源性硫化氫通過調控瘦素/瘦素受體通路抑制高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷。
　　中國糖尿病患者人數眾多，目前已超過1億人，糖尿病的主要危害在于其慢性并發(fā)癥。高血糖是糖尿病的一個重要特征，是引起糖尿病幾乎所有并發(fā)癥（如大血管病變、微血管病變、神經病變等）最為直接的因素。高血糖可通過多種病理生理機制，如引起血管內皮細胞功能損傷等，導致糖尿病的多種并發(fā)癥。
　　瘦素(leptin)

2、是一種主要由脂肪細胞分泌的激素，通過瘦素受體(LEPR)發(fā)揮其生物活性。作為細胞因子，瘦素可以發(fā)揮多種生物效應，如調控炎癥、繁殖和血管生成。瘦素/瘦素受體信號通路已在許多系統(tǒng)在生化和分子水平上被廣泛研究。新近證據表明，瘦素可能是一個潛在的糖尿病血管病變治療的新靶點。
　　硫化氫(H2S)是一種新型的氣體信號分子。生理濃度的H2S對多種細胞有保護作用，由于具有抗氧化和對胞內信號通路的調節(jié)作用，近年來H2S在糖尿病血管病變的治療作用吸

3、引了學者們的研究興趣。但是，外源性H2S能否通過調控瘦素/瘦素受體通路抑制高糖引起的血管內皮細胞損傷尚未明了。
　　目的：
　　1.探討瘦素/瘦素受體通路是否介導高糖對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的損傷;
　　2.H2S能否通過調控瘦素/瘦素受體通路抑制高糖所致的HUVECs損傷。
　　方法：
　　1.應用40mmol/L葡萄糖作用于HUVECs24h建立高糖(HG，40mmol/Lglucose)損傷

4、內皮細胞模型;
　　2.應用細胞計數檢測試劑盒（CCK-8）檢測細胞存活率;
　　3.Western Blot法測定瘦素和瘦素受體蛋白的表達水平;
　　4.Hoechst33258核染色熒光顯微鏡照相法檢測HUVECs凋亡的形態(tài)學與數量改變;
　　5.雙氯熒光素(DCFH-DA)染色熒光顯微鏡照相法檢測胞內活性氧(ROS)水平;
　　6.羅丹明123(Rh123)染色熒光顯微鏡照相法檢測HUVECs線粒體膜

5、電位(MMP)水平。
　　結果：
　　1.應用40mmol/L葡萄糖分別作用于HUVECs3～24h，3h開始明顯上調瘦素的表達水平，于9h時瘦素表達水平最高(p＜0.01);
　　2.應用40mmol/L葡萄糖分別作用于HUVECs3～24h，3h開始明顯上調瘦素受體的表達，于9h時瘦素受體表達水平達到峰值(p＜0.01);
　　3.應用400umol/L硫氫化鈉(NaHS，為H2S的供體)預處理HUVECs3

6、0min能抑制高糖對瘦素表達水平的上調作用(p＜0.01);
　　4.應用400umol/L NaHS預處理HUVECs30min能抑制高糖對瘦素受體表達水平的上調作用(p＜0.01);
　　5.應用400umol/L NaHS預處理HUVECs30min可明顯地減輕高糖誘導的HUVECs損傷，提高細胞存活率，減少細胞凋亡數量，減少胞內ROS堆積及MMP丟失(p＜0.01);
　　6.應用50ng/ml瘦素拮抗劑(LA

7、)預處理HUVECs1h也能產生與NaHS相似的內皮細胞保護作用，使細胞存活率升高，細胞凋亡減少，胞內ROS堆積及MMP丟失減少(p＜0.01)。
　　結論：
　　1.瘦素/瘦素受體通路介導了高糖誘導的HUVECs損傷;
　　2.外源性H2S通過抑制瘦素/瘦素受體通路對抗高糖導致的HUVECs損傷。
　　第二章 硫化氫通過調控JAK/STAT通路抑制高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷
　　在第一章中，已經證實H

8、2S可通過抑制瘦素/瘦素受體通路對抗高糖誘導的HUVECs損傷。
　　Janus激酶/信號轉導子和轉錄激活子(Janus kinase/Signal transducer andactivator of transcription，JAK/STAT)通路是最早被確認且最為重要的瘦素下游信號通路。瘦素與其受體結合后，改變其受體的構型，繼而激活JAK蛋白(主要是JAK2)，被激活的JAK2再激活STAT（STAT3）通路。有研究指出，

9、JAK/STAT通路參與瘦素誘導的心肌細胞肥大。還有人報道，高糖可通過激活JAK/STAT通路引起糖尿病腎病。但是，JAK/STAT通路是否介導高糖誘導的血管內皮細胞損傷尚未明了，相關研究較少，值得探討。
　　目的：
　　1.探討JAK/STAT通路是否介導高糖對HUVECs的損傷;
　　2.H2S能否通過調控JAK/STAT通路抑制高糖所致的HUVECs損傷。
　　方法：
　　1.應用40mmol/L葡萄

10、糖作用于HUVECs24h建立高糖(HG，40mmol/Lglucose)損傷內皮細胞模型;
　　2.應用CCK-8檢測細胞存活率;
　　3.Western Blot法測定磷酸化(p-)JAK2及p-STAT3蛋白的表達水平;
　　4.Hoechst33258核染色熒光顯微鏡照相法檢測HUVECs凋亡的形態(tài)學與數量改變;
　　5.DCFH-DA染色熒光顯微鏡照相法檢測胞內ROS水平;
　　6.Rh123染色

11、熒光顯微鏡照相法檢測HUVECs的MMP水平。
　　結果：
　　1.應用400umol/L NaHS預處理HUVECs30min能抑制高糖對p-JAK2表達的上調作用(p＜0.01);
　　2.應用400umol/L NaHS預處理HUVECs30min能抑制高糖對p-STAT3表達的上調作用(p＜0.01);
　　3.應用400umol/L NaHS預處理HUVECs30min可明顯地減輕高糖誘導的HUVECs

12、損傷，使細胞存活率升高，細胞凋亡數量減少，胞內活性氧(ROS)堆積及MMP丟失減少(p＜0.01）;
　　4.應用20μmol/L JAK/STAT通路抑制劑(AG490)預處理HUVECs30min也能起到與NaHS相似的內皮細胞保護作用，能提高細胞存活率，減少細胞凋亡，減少胞內ROS堆積及MMP丟失(p＜0.01）。
　　結論：
　　1.JAK/STAT通路介導了高糖誘導的HUVECs損傷;
　　2.H2S通