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文檔簡(jiǎn)介
1、現(xiàn)今,糖尿病已成為嚴(yán)重危害人類健康的全球流行性疾病,其血管并發(fā)癥是患者致殘、致死的主要因?yàn)椤Ec非糖尿病人群相比,糖尿病人群中動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的患病率高、發(fā)病年齡輕、病情進(jìn)展較快,多臟器同時(shí)受累較多。一些研究指出,高血糖可以加速細(xì)胞的衰老,而內(nèi)皮細(xì)胞衰老是動(dòng)脈粥樣硬化的早期病理改變,因此,研究高糖致內(nèi)皮細(xì)胞衰老的機(jī)制,從而發(fā)展有效阻斷藥物,是防治糖尿病大血管病變的有效途徑。
內(nèi)皮細(xì)胞是糖尿病血管病變的關(guān)鍵靶組織。它不僅在抗
2、凝血因子形成過(guò)程中起著保護(hù)屏障作用,而且其自身可分泌因子調(diào)節(jié)血管管腔和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用。正常生理狀態(tài)下,內(nèi)皮細(xì)胞的更新率很低,分裂增殖能力有限,但因損傷(如高糖刺激)導(dǎo)致細(xì)胞不斷的分裂將引起端粒縮短,細(xì)胞進(jìn)入衰老期,表現(xiàn)為SA-βgal活性增強(qiáng)、細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G0/G1期、衰老相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)陽(yáng)性以及端粒酶活性降低等;同時(shí),血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老過(guò)程中,分泌的各種生物學(xué)活性因子也在發(fā)生變化,如NO的合成下降、炎性因子合成增加、粘
3、附因子表達(dá)增多等。這些變化都將造成內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。可見(jiàn),衰老與糖尿病相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化存在密切關(guān)系。
端粒鐘學(xué)說(shuō)是衰老發(fā)生機(jī)制的學(xué)說(shuō)之一。端粒是真核細(xì)胞染色體末端的DNA序列,隨著細(xì)胞的每次分裂,端粒不斷縮短,當(dāng)縮短到一個(gè)閾值時(shí),便不能維持染色體的穩(wěn)定,使細(xì)胞失去分裂增殖能力而進(jìn)入了衰老階段。因此,端粒縮短被認(rèn)為是觸發(fā)細(xì)胞衰老的分子鐘,可作為衰老的生物標(biāo)記。端粒酶是一種核糖核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶,可以
4、在縮短的端粒末端加上新的重復(fù)序列,保持端粒長(zhǎng)度,在調(diào)節(jié)壽命與細(xì)胞增殖方面扮演著重要的角色。端粒酶活性的調(diào)控是多因素的,PI3K/Akt通路正是其中之一。對(duì)黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-MEL-28的研究發(fā)現(xiàn),在無(wú)血清培養(yǎng)24小時(shí)后腫瘤細(xì)胞Akt活性升高,端粒酶的活性增加2倍,而端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基(Human Telomerase Reverse Transcriptase Subunit,hTERT)的兩個(gè)XXRXRXXSXX序列也相應(yīng)出
5、現(xiàn)了磷酸化;應(yīng)用PI3K抑制劑可以降低腫瘤細(xì)胞端粒酶的活性并抑制hTERT的磷酸化。因此,Akt必然成為端粒酶十分重要的上游調(diào)節(jié)點(diǎn)。
氧化應(yīng)激的增加與NO生物利用度的減少在細(xì)胞衰老中起著重要的作用。有研究顯示高糖可以增加細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,而后者可通過(guò)抑制Src家族激酶的活性而縮短端粒的長(zhǎng)度,加快衰老的進(jìn)程。NO能與過(guò)量的ROS反應(yīng)而減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激的程度。NO被認(rèn)為是最主要的內(nèi)皮源性自分泌因子,它可以調(diào)節(jié)血管管腔大小,抑
6、制血小板聚集、抗凋亡、抑制平滑肌細(xì)胞增殖和白細(xì)胞粘附,因而在抗動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。很多研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮型NOS(eNOS)的表達(dá)和NO的合成隨年齡的增加而下降,雖然其機(jī)制目前還不明確,但有研究表明PI3K/Akt可以介導(dǎo)eNOS的磷酸化,亦有研究顯示2型糖尿病患者內(nèi)皮功能紊亂與PI3K/Akt/eNOS通路受到抑制有關(guān)。因此,在內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)系統(tǒng)應(yīng)是防治糖尿病大血管病變的一個(gè)重要靶點(diǎn)。
L-
7、Arg是NO合成的前體物質(zhì),在1992年Creager和Dubois-Rarde兩組學(xué)者首次斷定,補(bǔ)充eNOS作用的底物L(fēng)-Arg是增加內(nèi)皮產(chǎn)生生物活性NO的一種方法。L-Arg改善內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制相對(duì)多樣化,尚未闡明,這種作用可能與增力INO的合成和eNOS蛋白表達(dá),減少ROS的形成有關(guān)。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)在體外模擬高糖狀態(tài),觀察高血糖是否加速人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老,其對(duì)NO、eNOS蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄水平的影響,以及與PI
8、3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)系,而L-Arg是否可以延緩高糖加速的內(nèi)皮細(xì)胞衰老的進(jìn)程,其作用機(jī)制是否與PI3K/Akt通路有關(guān),為進(jìn)一步探討糖尿病大血管病變發(fā)病機(jī)制及其防治手段提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
材料與方法:
1、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株培養(yǎng),不同濃度的葡萄糖溶液孵育細(xì)胞、高糖(33 mM)和/或不同濃度L-arginine共同孵育細(xì)胞,以及同一濃度孵育不同的時(shí)間,收集內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液;分別用PI3K/Akt特異性抑制
9、劑LY294002、eNOS特異性抑制劑L-NAME進(jìn)行預(yù)處理2 h,然后于上述因素孵育細(xì)胞,收集內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液,用于指標(biāo)檢測(cè)。
2、衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)是通過(guò)染色計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分比來(lái)確定,后者是指1000個(gè)細(xì)胞中被染成藍(lán)綠色細(xì)胞的百分比。
3、采用PCR-ELISA法檢測(cè)端粒酶的活性。
4、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧及分析細(xì)胞周期。
5、應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)
10、PI3K、Akt、eNOS mRNA的表達(dá)。
6、采用Westemblot法檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p-Akt(Ser-473)、Akt、p-eNOS(Ser-1177)、eNOS蛋白的表達(dá)。
7、采用硝酸鹽還原酶還原硝酸鹽為亞硝酸鹽,然后通過(guò)經(jīng)典的Griess reagent檢測(cè)亞硝酸鹽,從而測(cè)定出總一氧化氮。
結(jié)果:
1、隨著糖濃度的增加(即5.5、11、22、33 mmol/L)
11、SA β-gal活性逐漸增強(qiáng)(P<0.01),端粒酶活性逐漸減弱(P<0.01),G0/G1期細(xì)胞不斷增加(P<0.01),S期細(xì)胞不斷減少(P<0.01)。
2、隨著糖濃度的不斷增加,細(xì)胞內(nèi)ROS逐漸增多(P<0.01),而NO的產(chǎn)量逐漸減少(P<0.001)。
3、與正常對(duì)照組相比,33mmol/L糖濃度組72 h PI3K、Akt、eNOS mRNA的表達(dá)明顯下降(P<0.05)。
4、與
12、正常對(duì)照組相比,33mmol/L糖濃度組48 h p-Akt(Ser-473)/Akt、p-eNOS(Ser-1177)/eNOS蛋白表達(dá)量的比值明顯減弱(P<0.01)。
5、應(yīng)用不同濃度L-arginine(0.4、0.8、1.6mmol/L)與高糖(33 mmol/L)共同干預(yù)細(xì)胞,不同程度地減弱了SA β-gal活性(與高糖組比較,P<0.01),增強(qiáng)了端粒酶的活性(P<0.01),G0/G1期細(xì)胞較高糖組明顯減少
13、(P<0.01),S期細(xì)胞明顯增多(P<0.01)。而3.2mmol/L的L-arginine出現(xiàn)相反作用,各指標(biāo)與高糖組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
6、與高糖組比較,L-arginine(0.4、0.8、1.6mmol/L)明顯減少細(xì)胞內(nèi)的ROS水平(P<0.001),明顯增多NO的合成(P<0.001)。
7、與高糖組比較,L-arginine(0.8 mmol/L)作用內(nèi)皮細(xì)胞72 h使PI3K、Akt、eNO
14、SmRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。
8、與高糖組比較,L-arginine(0.4、0.8、1.6mmol/L)明顯增加了p-Akt(Ser-473)/Akt、p-eNOS(Ser-1177)/eNOS蛋白的表達(dá)量的比值(P<0.01)。
9、PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002及eNOS特異性抑制劑L-NAME可以抑制L-arginine的抗衰老作用。
結(jié)論:
1
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