Sirt3對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老及功能障礙作用的研究.pdf

1、背景：
　　血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管壁與血液之間的屏障，具有抗凝、調(diào)節(jié)血管張力參與炎癥反應(yīng)等作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷主要是指一氧化氮NO減少引起的內(nèi)皮細(xì)胞舒張功能減退。內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷被認(rèn)為是高血壓、冠心病等心血管疾病的早期發(fā)病機(jī)制。衰老內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及舒張能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷修復(fù)、血管生成、內(nèi)分泌及血管舒張功能等受損，是心腦血管疾病隨年齡增加的主要因素之一。AngⅡ作為RAAS系統(tǒng)中最主要的生物效應(yīng)分子，可以直接或

2、間接的調(diào)節(jié)NADPH氧化酶的活性，引起ROS的生成增多，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的衰老。
　　沉默信息調(diào)節(jié)因子2蛋白(silent mating type information regulation2 protein，Sirtuin)家族是廣泛存在于原核生物和真核生物中的依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的組蛋白去乙?；福湓谶M(jìn)化上高度保守。哺乳動(dòng)物Sirtuin家族共有7個(gè)家族成員，分別為Sirt1～7，每個(gè)蛋白的細(xì)胞

3、靶點(diǎn)和細(xì)胞定位不同。Sirt3主要定位于線粒體基質(zhì)和細(xì)胞核中。它激活被證實(shí)與延長(zhǎng)人類壽命相關(guān)。其組織器官分布非常廣泛，在物質(zhì)代謝活躍的組織如肌肉、肝臟、腎臟和心臟中表達(dá)較高。研究表明，Sirt3可通過(guò)去乙酰化相關(guān)蛋白，增加ROS清除酶活性和穩(wěn)定線粒體功能，以減少ROS的生成、提高線粒體內(nèi)ROS的清除作用，從而抑制線粒體內(nèi)ROS的蓄積。并且Sirt3可以影響代謝相關(guān)的衰老性疾病如心臟疾病、癌癥等的發(fā)生。提示Sirt3可能通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)

4、胞線粒體內(nèi)ROS的蓄積，影響AngⅡ誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老過(guò)程及內(nèi)皮細(xì)胞功能。
　　目的：
　　1.探討Sirt3在AngⅡ誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老中的作用。
　　2.探討Sirt3對(duì)AngⅡ刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。用ECM培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2細(xì)胞孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、Sirt3-siRNA

5、組、AngⅡ組、Sirt3-siRNA+ AngⅡ組。
　　2.Sirt3-siRNA轉(zhuǎn)染
　　Sirt3-siRNA序列由試劑公司合成。用Western-blotting法篩選出抑制效率最高的一組抑制序列后，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.Western blot
　　提取各組細(xì)胞總蛋白，Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞Sirt3、P16、P21、eNOS表達(dá)水平

6、。
　　4.各組細(xì)胞衰老情況檢測(cè)
　　通過(guò)β-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮衰老情況。
　　5.各組細(xì)胞eNOS活性檢測(cè)
　　運(yùn)用一氧化氮檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞eNOS活性。
　　6.各組細(xì)胞上清總NO含量檢測(cè)
　　采用硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞上清總NO水平。
　　7.各組檢測(cè)ROS水平檢測(cè)
　　采用DCFH-DA法測(cè)定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用

7、GraphPad Prism6統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以(x)±s表示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較時(shí)采用t檢驗(yàn)，多個(gè)實(shí)驗(yàn)組比較時(shí)采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.Western blot顯示3條抑制序列中，抑制序列1Sirt3蛋白表達(dá)最少，抑制效率最高，故選擇序列1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.Western blot顯示AngⅡ濃度為10-7，10-6，10-5 mol/L的三組細(xì)

8、胞Sirt3的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，其中10-6 mol/L組的Sirt3表達(dá)量最高。
　　3.Western blot顯示，與對(duì)照組相比，AngⅡ組P16、P21的表達(dá)量明顯升高，轉(zhuǎn)染Sirt3-siRNA后P16、P21表達(dá)量進(jìn)一步升高。
　　4.β-半乳糖苷酶染色顯示AngⅡ組β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染Sirt3-siRNA后β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率更高。
　　5.與對(duì)照組相比

9、，AngⅡ組細(xì)胞eNOS活性、細(xì)胞上清NO水平降低，而eNOS的蛋白表達(dá)增多。轉(zhuǎn)染Sirt3-siRNA后，eNOS活性、細(xì)胞上清NO水平進(jìn)一步降低，eNOS的蛋白表達(dá)也減少了。
　　6.與對(duì)照相比，AngⅡ組細(xì)胞ROS水平明顯升高，轉(zhuǎn)染Sirt3-siRNA后細(xì)胞ROS水平進(jìn)一步升高。
　　結(jié)論：
　　1.Sirt3可以延緩AngⅡ誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞衰老的過(guò)程。
　　2.Sirt3對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)