組織蛋白酶D對AGEs誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 CTSD在AGEs誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮損傷中的作用
　　糖尿病已成為危害人類健康的三大慢性疾病之一，其并發(fā)癥是致死致殘的主要原因。糖尿病患者常常合并大血管和微血管病變，這些血管損傷常常共同存在，并促進(jìn)高血壓、冠心病等疾病發(fā)生發(fā)展。血管內(nèi)皮損傷是血管損傷的關(guān)鍵起始環(huán)節(jié)，在糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。
　　晚期終末糖基化產(chǎn)物(Advanced glycation

2、 end products，AGEs)能夠可以引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡。研究顯示，AGEs可能是產(chǎn)生“代謝記憶”的主要原因。然而，由AGEs引發(fā)的“代謝記憶”導(dǎo)致血管病變的產(chǎn)生機(jī)制仍不十分清楚。
　　組織蛋白酶D(CathepsinD，CTSD)是一種具有多功能的天冬氨酸水解酶，參與調(diào)節(jié)凋亡和自噬等多種細(xì)胞過程，在維持細(xì)胞生存和分化等方面具有重要的調(diào)控作用。
　　目的：
　　本課題旨在探索CTSD在

3、AGEs引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilical vein endothelial cell，HUVEC)中的作用及其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　培養(yǎng)人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)CTSD的HUVEC細(xì)胞株(LV-CTSD)和穩(wěn)定過表達(dá)去除酶活性的CTSD突變體的HUVEC細(xì)胞株(LV-D295N)。
　　1、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，用不同濃度的AGEs(50μg/ml，100μg/ml，

4、150μg/ml和200μg/ml)處理24小時(shí);然后選用(100μg/ml)AGEs處理不同的時(shí)間(6h，12h，24h和48h);使用AGEs(100μg/ml，24h)處理HUVEC，MTT實(shí)驗(yàn)、RTCA細(xì)胞分析系統(tǒng)和EdU染色觀察細(xì)胞增殖情況。
　　2、使用AGEs(100μg/ml，24h)處理HUVEC，劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell遷移小室實(shí)驗(yàn)以及RTCA細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測HUVEC遷移能力;觀察遷移細(xì)胞數(shù)目。
　

5、　3、用AGEs(100μg/ml，24h)處理HUVEC，用Western blotting檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62的表達(dá)水平以及CTSD的表達(dá)水平。
　　4、用AGEs(100μg/ml，24h)處理空載體組、LV-CTSD組和LV-D295N組細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)、RTCA細(xì)胞分析系統(tǒng)和EdU染色觀察細(xì)胞增殖情況;用劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell遷移小室觀察HUVEC遷移能力;計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)目，繪制遷移細(xì)胞指數(shù)曲線。

6、
　　5、用AGEs(100μg/ml，24h)處理空載體組、LV-CTSD組和LV-D295N組細(xì)胞，用免疫熒光實(shí)驗(yàn)，熒光顯微鏡下觀察LC3-Ⅱ點(diǎn)簇狀數(shù)量及分布情況。AO熒光染料染色，檢測細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡以及自噬溶酶體的變化。
　　結(jié)果：
　　1、AGEs抑制HUVEC的活性、增殖和遷移(P＜0.05)。
　　2、AGEs顯著增加HUVEC內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ和P62的表達(dá)水平，并且增加細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡的累積(

7、P＜0.05)。
　　3、AGEs呈時(shí)間依賴的方式顯著降低HUVEC內(nèi)CTSD的表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　4、過表達(dá)CTSD能夠促進(jìn)自噬溶酶體的降解(P＜0.05)。
　　5、過表達(dá)CTSD能夠促進(jìn)AGEs誘導(dǎo)的HUVEC的增殖能力，而過表達(dá)D295N不能改善，提示該作用與其酶活性有關(guān)(P＜0.05)。
　　6、過表達(dá)CTSD及過表達(dá)D295N促進(jìn)AGEs誘導(dǎo)的HUVEC遷移能力(P＜0.05)，提示該作用

8、與其酶活性無關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、在HUVEC中，AGEs通過與CTSD相互作用，抑制自噬溶酶體的降解從而抑制HUVEC增殖;上調(diào)CTSD的表達(dá)能促進(jìn)自噬溶酶體的降解，促進(jìn)自噬流，從而促進(jìn)HUVEC增殖，該作用與其酶活性有關(guān)。
　　2、在HUVEC中，AGEs通過與CTSD相互作用，抑制HUVEC遷移，上調(diào)CTSD的表達(dá)能促進(jìn)HUVEC遷移，且該作用與其酶活性無關(guān)。
　　第二部分 AGEs對血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體

9、能量代謝的影響
　　糖尿病血管并發(fā)癥是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。血管內(nèi)皮損傷是糖尿病血管病變發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵起始環(huán)節(jié)。晚期終末糖基化產(chǎn)物(AGEs)能夠引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷，然而其分子機(jī)制尚不清楚。
　　目的：
　　本研究主要通過海馬能量分析儀觀察HUVEC內(nèi)線粒體能量代謝水平，探討AGEs對HUVEC線粒體能量代謝的影響。
　　方法：
　　1、培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，AGE

10、s(100μg/ml，24h)處理細(xì)胞后，用MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性，RTCA細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞增殖能力。
　　2、采用海馬能量儀檢測線粒體能量代謝狀況;用100μg/ml的AGEs處理HUVEC，觀察其對基礎(chǔ)氧耗、剩余呼吸儲備、最大呼吸儲備、ATP相關(guān)氧耗、質(zhì)子漏、非線粒體相關(guān)氧耗、氧氣消耗率和胞外酸化率的影響。
　　3、100μg/ml的AGEs處理HUVEC，用Mitotracker和TMRE熒光染料染色，檢測線粒體膜電

11、位水平的變化。
　　4、100μg/ml的AGEs處理HUVEC，western blot檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物I-V表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1、AGEs能夠顯著抑制HUVEC的增殖。
　　2、AGEs處理HUVEC后發(fā)現(xiàn)，氧氣消耗率(OCR)顯著降低，胞外酸化率(EACR)顯著降低。
　　3、AGEs處理HUVEC后，線粒體膜電位明顯降低。
　　4、AGEs處理HUVEC后，線粒體呼吸鏈復(fù)