芍藥苷對(duì)缺氧損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VEC)作為組織與血液間的第一道屏障，是最先感受缺氧的細(xì)胞之一。在缺血性心臟病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞受損、功能障礙是其中的關(guān)鍵因素。芍藥苷(paeoniflorin，Pae)是從赤芍中提取的生物活性成分，是一種蒎烷單萜苷，文獻(xiàn)報(bào)道有抗心肌缺血的作用。為了深入探討芍藥苷保護(hù)心肌缺血損傷的作用機(jī)制，本研究在成功培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical

2、vein endothelial cells，HUVEC)的基礎(chǔ)上，建立穩(wěn)定可靠的體外細(xì)胞缺氧模型，模擬心肌缺血缺氧微環(huán)境，探討HUVEC在缺氧條件下細(xì)胞中SOD活性和MDA含量的變化，細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性和NO含量的變化，內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS、粘附分子以及NF-кB表達(dá)的變化，同時(shí)觀(guān)察Pae的干預(yù)作用，希冀揭示Pae抗心肌缺血的可能作用機(jī)制。 方法：采用膠原酶灌注法原代提取HUVEC，根據(jù)鏡下內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征及免疫熒光法

3、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)von willebrand factor (vWF)，確定分離的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源，細(xì)胞傳至3～5代時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用法國(guó)BioMérieuxRsa公司缺氧裝置系統(tǒng)，建立HUVEC缺氧模型。MTT法檢測(cè)Pae對(duì)缺氧損傷的HUVEC活性的影響，利用試劑盒檢測(cè)Pae對(duì)缺氧損傷的HUVEC細(xì)胞中SOD活性和MDA含量以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性，觀(guān)察Pae對(duì)缺氧損傷的HUVEC細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。分別利用硝酸還原酶法及免疫細(xì)胞化學(xué)

4、法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中一氧化氮的含量及eNOS的活性，用細(xì)胞ELISA法分析Pae對(duì)缺氧損傷HUVEC表達(dá)粘附分子ICAM-1，VCAM-1的影響，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Pae對(duì)缺氧損傷HUVEC細(xì)胞中NF-κB的影響，進(jìn)而分析Pae保護(hù)缺氧損傷的HUVEC的機(jī)制。 結(jié)果：1.培養(yǎng)的細(xì)胞倒置顯微鏡下觀(guān)察表現(xiàn)為典型的鋪路石樣形態(tài)學(xué)特征，融合后呈現(xiàn)單層生長(zhǎng)和接觸抑制的特性；免疫熒光法檢測(cè)到95﹪以上的細(xì)胞胞漿內(nèi)有vWF的表達(dá)，表明所分離的

5、細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源。2.MTT結(jié)果表明Pae能抑制缺氧引起的HUVEC減少，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性。3.芍藥苷可以使缺氧損傷的內(nèi)皮細(xì)胞中SOD活性明顯升高而MDA含量明顯降低，使細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性降低。4.缺氧可導(dǎo)致HUVEC產(chǎn)生的NO明顯減少，降低eNOS的表達(dá)。Pae能使缺氧損傷的HUVEC產(chǎn)生的NO增加，并有劑量依賴(lài)性，Pae各劑量組均能增加eNOS的表達(dá)。5.缺氧能顯著增加HUVEC表達(dá)ICAM-1，VCAM-。Pae能抑制

6、缺氧損傷的HUVECICAM-1及VCAM-1的表達(dá)升高。且呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性。6.缺氧可誘導(dǎo)HUVEC顯著表達(dá)NF-κB，Pae各劑量組均能明顯降低NF-κB的表達(dá)。 結(jié)論：1.應(yīng)用膠原酶灌注消化法分離HUVEC，并用免疫熒光法對(duì)所分離的細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，證實(shí)為內(nèi)皮細(xì)胞，為后續(xù)的試驗(yàn)提供了細(xì)胞來(lái)源。 2.建立了HUVEC缺氧模型，模擬體內(nèi)心肌缺血、缺氧的微環(huán)境，為抗心肌缺血藥物體外機(jī)理研究提供了穩(wěn)定可靠的細(xì)胞模型。