高糖刺激對人臍靜脈內(nèi)皮細胞腎素前體表達的影響.pdf

1、背景：動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴重危害人類健康的疾病，迄今其機理的研究已進行了數(shù)十年。目前一致認為，內(nèi)皮功能紊亂和炎癥反應(yīng)在AS的形成過程中發(fā)揮極其重要的作用。許多危險因素可導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，激活一系列信號通道蛋白，促進AS的發(fā)生發(fā)展。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是心血管系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其過度激活可通過升高血壓、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、致內(nèi)皮細胞功能紊亂等方式促進動脈粥樣硬化的形成。既往認為，經(jīng)典RAS系

2、統(tǒng)中，腎素的作用是將血管緊張素原(Aog)轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)，進而生成血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)發(fā)揮主要效應(yīng)，而腎素前體則無任何生物學(xué)活性。近年來，隨著腎素（前體）受體[(pro)renin receptor，(P)RR]研究的深入，對腎素前體的功能有了更深刻的認識。一系列研究表明，腎素或腎素前體與(P)RR結(jié)合后可以發(fā)揮不依賴于經(jīng)典的RAS所產(chǎn)生的AngⅡ的病理生理學(xué)作用，使腎系膜細胞增殖，系膜基質(zhì)增多，血管平滑肌細胞遷移等

3、作用，導(dǎo)致實驗?zāi)Ｐ统霈F(xiàn)血壓升高、蛋白尿、腎小球硬化等病理生理改變。本課題組前期實驗證實腎素（前體）及其受體在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)有表達并發(fā)揮重要作用。
　　 高血糖已被證實是動脈粥樣硬化最重要的危險因素之一。高糖可刺激細胞表面葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)表達增加，進一步激活細胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及炎癥因子的表達。目前已有實驗證實高糖刺激可使得人腎小球系膜細胞RAS活性明顯增高，腎素、腎素前體、血管緊張素原、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等

4、表達增加。高血糖可導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，使局部腎素表達增高，炎性因子表達增多，但是高糖刺激對內(nèi)皮細胞腎素前體表達的影響尚未被報道。本實驗將通過模擬高血糖環(huán)境，觀察人臍靜脈內(nèi)皮細胞腎素前體表達的變化。
　　 目的：觀察離體培養(yǎng)的HUVEC，在不同葡萄糖濃度及作用時間下HUVEC腎素前體mRNA的表達情況以及上清液中腎素前體濃度變化。
　　 方法：1．體外培養(yǎng)原代HUVECs。
　　 2．選擇狀態(tài)良好的2-3代人臍靜脈內(nèi)

5、皮細胞(HUVEC)，分為空白組、正常葡萄糖濃度組、高濃度葡萄糖組1、高濃度葡萄糖組2，分別給予葡萄糖濃度0mM、5mM、25mM、40mM刺激，觀察HUVEC中腎素前體mRNA的表達變化。
　　 3．為觀察滲透壓變化對內(nèi)皮細胞造成的影響，設(shè)立甘露醇對照實驗組。分別給予甘露醇0mM、5mM、25mM、40mM刺激，觀察HUVEC中腎素前體mRNA的表達變化。
　　 4．選擇狀態(tài)良好的2-3代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)

6、，給予葡萄糖濃度40mM分別刺激0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d后，收集內(nèi)皮細胞mRNA，觀察不同刺激時間下，HUVEC中腎素前體mRNA的表達變化。
　　 5．上述收集的腎素前體mRNA用RT-PCR進行檢測。
　　 6．細胞培養(yǎng)上清液中腎素前體用ELISA試劑盒進行檢測。
　　 結(jié)果：1．與空白組相比，正常葡萄糖濃度(5mM)未造成腎素前體mRNA表達明顯增加；高濃度葡萄糖刺激可造成腎素前體mRNA表

7、達明顯上調(diào)，尤以40mM組為著。
　　 2．設(shè)立的甘露醇對照實驗組，沒有表現(xiàn)出明顯變化。
　　 3．在40mM葡萄糖濃度刺激下，HUVECs中腎素前體mRNA表達明顯上調(diào)，且呈現(xiàn)一定的時間依賴性。
　　 4．高糖刺激下HUVECs培養(yǎng)液中，腎素前體的濃度升高并呈現(xiàn)時間依賴性。
　　 結(jié)論：1．葡萄糖可刺激HUVEC腎素前體mRNA表達明顯上調(diào)，具備濃度依賴性。
　　 2．滲透壓的變化并未對內(nèi)皮細胞