辛伐他汀對(duì)Tribbles在脂多糖刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 1999年ROSS提出動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥疾病，它的形成是血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞與炎癥介質(zhì)相互作用的結(jié)果，以粥樣斑塊中出現(xiàn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞為特征。血管內(nèi)皮細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸血液，血液中的異常物質(zhì)可直接影響內(nèi)皮細(xì)胞，如ox-LDL等。血管內(nèi)皮細(xì)胞受到刺激后，可分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)白細(xì)胞粘附、血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移等。 Tri

2、bbles是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種抑制有絲分裂的蛋白激酶，也稱為神經(jīng)細(xì)胞死亡誘導(dǎo)蛋白激酶（SINK）。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)有三種TRBs基因家族成員：TrbI，Trb2，Trb3。Tribbles蛋白擁有一個(gè)相同的中心區(qū)，以及70-100個(gè)氨基酸殘基的氮末端和25個(gè)殘基的碳末端區(qū)。此中心區(qū)是一個(gè)類似絲氨酸--蘇氨酸蛋白激酶，但缺乏賴氨酸活性位點(diǎn)的區(qū)域，因而具有激酶活性調(diào)控作用，可調(diào)節(jié)MAPK上游MAPKK的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)MAPK的磷酸化，而MAP

3、K可與轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B和AP-1等的表達(dá)有關(guān)。 脂多糖為經(jīng)典的炎癥刺激物，是實(shí)驗(yàn)中最常用的炎癥刺激因子。脂多糖可激活內(nèi)皮細(xì)胞，促使NO、氧自由基、趨化因子、細(xì)胞因子、前列腺素等的表達(dá)，這些炎癥因子通過自分泌或旁分泌等途徑促使細(xì)胞損傷，內(nèi)皮細(xì)胞間隙增大，血管基膜暴露，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等遷移內(nèi)皮下，致使損傷加劇。脂多糖可通過TLR-4激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中MAPKs及NF-κ B等信號(hào)傳導(dǎo)途徑。 他汀類（statins）

4、藥物屬于3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA）抑制劑，可以降低血清膽固醇的含量，是治療動(dòng)脈粥樣硬化的常用藥。越來越多的研究表明，他汀類藥物不僅具有降脂作用，還具有抗炎作用，其抗炎作用主要通過抑制NF-κ B途徑實(shí)現(xiàn)。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用脂多糖作為炎癥刺激物，辛伐他汀作為保護(hù)藥物，觀察Tribbles在脂多糖激活的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的mRNA表達(dá)變化以及辛伐他汀對(duì)其表達(dá)的影響。 方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)：取新鮮臍

5、帶，分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)，鑒定，傳代，第2-3代的細(xì)胞用來實(shí)驗(yàn)。 2.細(xì)胞分組：將細(xì)胞隨機(jī)分成12h、24h兩組，每組又分為：①對(duì)照組；②脂多糖組（100ng/mL）：③辛伐他汀組（5μg/mL）；④脂多糖與辛伐他汀共作用組。吸去細(xì)胞上清液后將細(xì)胞凍存在-80℃留做熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。 3.收集細(xì)胞，分別抽取mRNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IL-6、TNF-α、Trb1、Trb2及Trb3的

6、mRNA表達(dá)，記錄結(jié)果。 4.上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞鑒定結(jié)果：形態(tài)學(xué)鑒定，相差顯微鏡下，內(nèi)皮細(xì)胞分布均勻，單層生長，形態(tài)為多角形，鵝卵石狀鑲嵌排列；內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原SABC法檢測(cè)鑒定，相差顯微鏡下，內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中可見棕黃色顆粒，鑒定結(jié)果為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。 2.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果：與對(duì)照組相比，脂多糖組IL-6、TNF-α、Trb1及Trb3

7、的mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)（P>0.05）；與脂多糖組相比，脂多糖與辛伐他汀共作用組IL-6、TNF-α、Trb1及Trb3的mRNA表達(dá)明顯減少（P<0.05）。 結(jié)論： 1.脂多糖可以誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、TNF-α、Trb1及Trb3的mRNA表達(dá)增加。 2.辛伐他汀可以抑制由脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、TNF-α、Trb1及Trb3的mRNA表達(dá)。 3.Trb1及Trb3可促進(jìn)脂多糖