HDL和辛伐他汀對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶表達(dá)和活性氧生成的影響.pdf

1、研究背景:尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH氧化酶,NOX)是由多個亞基組成的酶復(fù)合體,包含胞膜成分細(xì)胞色素b558(gp91phox和p22phox)和胞漿成分p47phox、p67phox及Rac(小的GTP結(jié)合蛋白)五個亞組分。gp91phox(有NADPH、heme、FAD的潛在結(jié)合位點(diǎn))和p22phox是NADPH

2、氧化酶的酶促核心,它們受胞漿成分p47phox、p67phox及Rac的調(diào)節(jié)。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),在各種組織中存在著5種NOX的同功酶,分別稱為NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5,其中NOX2和NOX4均在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),但NOX4表達(dá)水平比NOX2高20倍。進(jìn)一步的研究表明,血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)主要來源于NOX4。我們的研究證實(shí),高濃度低密度脂蛋白(low

3、density lipoprotein,LDL)通過上調(diào)NOX4的表達(dá)和增加ROS的產(chǎn)生引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,提示由高濃度LDL引起的氧化應(yīng)激在動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。令人感興趣的是,拮抗動脈粥樣硬化的保護(hù)性因素高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)和降脂的他汀類藥物近年來已被證實(shí)具有抗氧化的作用,但它們的抗氧化機(jī)制尚不清楚。本研究首先用HDL及其主要載脂蛋白apoAI和辛伐他汀預(yù)處理人臍靜脈內(nèi)

4、皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),再加入高濃度LDL觀察NOX各亞基表達(dá)及ROS生成的變化,探討HDL和辛伐他汀的抗氧化機(jī)制。
　　目的:分析HUVEC中NOX各亞基的表達(dá);分析HDL及其主要載脂蛋白apoAI與辛伐他汀對HUVEC內(nèi)NOX4、NOX2、p67phox、p22phox和Rac表達(dá)及ROS生成的影響,研究HDL、apoAI和辛伐他汀對LDL的拮抗作用。

5、
　　方法:用Ⅱ型膠原酶消化法分離培養(yǎng)HUVEC;用人髓系白血病細(xì)胞株U937作為檢測p47phox、p67phox、p22phox和Rac mRNA表達(dá)的陽性對照,用RT-PCR檢測HUVEC中p47phox、p67phox、p22phox和Rac mRNA表達(dá);用RT-PCR,Western-blotting觀察NOX4、NOX2表達(dá)的變化;用免疫熒光檢測HUVEC中p67phox和p22phox蛋白的表達(dá)變化;用流式細(xì)胞儀檢

6、測細(xì)胞內(nèi)ROS的變化。
　　結(jié)果:HUVEC中表達(dá)p67phox、p22phox和Rac mRNA,不表達(dá)p47phox mRNA;HDL處理HUVEC能下調(diào)NOX4、NOX2、p67phox mRNA和蛋白水平,但HDL不影響p22phox和Rac的表達(dá);辛伐他汀處理HUVEC能下調(diào)NOX4、p22phox、p67phox mRNA和蛋白水平,但辛伐他汀不影響NOX2和Rac的表達(dá)。用HDL預(yù)處理再加高濃度LDL刺激時,NOX4

7、和p67phox表達(dá)下調(diào),不影響p22phox、NOX2和Rac的表達(dá),ROS生成量減少;用apoAI預(yù)處理再加高濃度LDL刺激時,NOX4表達(dá)下調(diào),ROS生成量減少;用辛伐他汀預(yù)處理再加高濃度LDL刺激時,NOX4、p67phox和p22phox表達(dá)下調(diào),NOX2和Rac的表達(dá)沒有變化,ROS生成量減少。高濃度LDL刺激HUVEC時,NOX4表達(dá)上調(diào),但NOX2、Rac、p22phox和p67phox的表達(dá)沒有明顯變化,細(xì)胞內(nèi)ROS生

8、成增加。
　　結(jié)論:
　　(1) HUVEC中表達(dá)NOX亞單位p67phox、p22phox和Rac mRNA,但不表達(dá)p47phox mRNA；
　　(2) HDL、apoAI和辛伐他汀可下調(diào)HUVEC NOX4表達(dá),降低ROS水平;HDL可下調(diào)NOX2表達(dá),但辛伐他汀不影響NOX2表達(dá);
　　(3) HDL可下調(diào)HUVEC p67phox表達(dá),而辛伐他汀可下調(diào)HUVEC p67phox、p22phox mRN