活性氧在人臍靜脈內皮細胞衰老中的作用和睪酮的干預研究.pdf

1、背景和目的： 隨著年齡的增長，血管壁的結構和功能會發(fā)生重大變化，包括血管腔擴大，血管內膜和中層增厚，血管僵硬度增加，部分血管壁細胞衰老，還有代表血管內皮功能的內皮依賴性血管舒張功能減弱，這些變化改變了各種心腦血管疾病的病理生理機制，從而改變了疾病發(fā)生的閾值、嚴重程度和預后，可能是多種增齡相關性疾病，包括動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)形成的共同機制之一。 血管內皮細胞位于血管腔內壁，維持著血管內皮的完

2、整及其功能的正常。血管內皮不僅具有屏障功能，維持血流的通暢，還具有重要的內分泌功能，它可以通過膜受體感知血流動力學和血源性信號的變化，合成并分泌多種生物活性物質，對維護血管結構和功能的正常和凝血系統(tǒng)的穩(wěn)定起著重要的作用。血管內皮功能障礙與諸多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關，目前認為它是AS形成初始階段的重要改變。近年來的研究表明，體外培養(yǎng)的衰老的血管內皮細胞會發(fā)生形態(tài)與功能的改變，表現(xiàn)為細胞肥大扁平，內源性一氧化氮分泌減少，呈現(xiàn)出促炎與促栓的

3、表型，這或許在增齡相關的血栓栓塞性疾病中起著重要作用。 氧化應激是經典的衰老機制學說之一。以往研究認為，活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)通過氧化應激導致細胞DNA損傷，DNA修復失代償，引發(fā)一系列基因與蛋白的表達異常，細胞發(fā)生衰老。在AS發(fā)病機制研究中發(fā)現(xiàn)，ROS誘導一些炎癥因子基因的表達獨自或聯(lián)合參與了AS的形成過程。隨著年齡的增長，這些因素在血管壁所造成的損傷不斷積累，很可能成為誘導血管衰老發(fā)生

4、與發(fā)展的最重要因素之一，從而使老年人更容易發(fā)生AS。 在增齡過程中，除了血管衰老本身因素之外，老年人易發(fā)AS的另一個具有老年人群特點的危險因素是體內隨年齡增長而發(fā)生的性激素平衡的改變。在增齡過程中，體內性激素發(fā)生相應變化，其中性激素水平在更年期后發(fā)生的變化顯示出性激素對機體作用的重要性。流行病學研究表明，男性40歲或50歲后，體內睪酮水平明顯降低，而且，男性內源性睪酮水平與多種老年性疾病密切相關。男性內源性睪酮水平與男性血管結構

5、隨年齡增長發(fā)生的變化之間有無一定的聯(lián)系呢?目前研究還較少。睪酮對血管內皮細胞衰老的影響，目前還沒有文獻報道，其作用機制也還沒有明確。 因此，我們使用低濃度過氧化氫(hydrogenperoxide，H2O2)誘導人臍靜脈內皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)衰老，通過觀察測定HUVECs在ROS的作用下各種衰老指標(細胞增殖能力、β-半乳糖苷酶的表達)、細胞內氧化應激水平以

6、及細胞周期調控因子(去磷酸化Rb蛋白)的表達變化，探討HUVECs衰老的機制，并予睪酮及性激素受體拮抗劑干預，探討不同濃度睪酮對活性氧誘導HUVECs早衰的干預作用及其可能的作用機制，為明確睪酮在干預血管老化中的作用，及其作用機制提供新的理論和實驗依據，或許能為增齡相關脈管系統(tǒng)疾病的防治提供新的靶點。 方法： 1、培養(yǎng)HUVECs，采用第4～6代細胞。使用60pmol/LH2O2作用72h，誘導HUVECs發(fā)生衰老。

7、 2、分組：①正常對照組：給予低血清(2％)培養(yǎng)基；②H2O2對照組：給予低血清培養(yǎng)基+H2O2(60pmol/L)：③睪酮干預組：分別給予睪酮3nmol/L，30nmol/L，300nmol/L，3μmol/L培養(yǎng)30min后，再加予H2O2(60μmol/L)；④機制研究組：分別給予ICI182，780、氟他胺1μmol/L培養(yǎng)30min后，給予睪酮(30nmol/L)，30min后再給予H2O2(60μmol/L)?；蛳冉o予抗

8、氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)1μmol/L，培養(yǎng)30min后，再給予H2O2(60μmol/L)。 3、MTT法檢測細胞增殖能力。細胞染色法檢測各組細胞的衰老相關的β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβgalactosidase，SA-β-gal)表達情況。2，7-二氯熒光黃(2，7-dichlorofluorescein，DCF)熒光顯色檢測細胞內活性氧水

9、平。WesternBlot法檢測去磷酸化Rb蛋白的表達量。 結果： 1、不同濃度睪酮及生理濃度睪酮合用性激素受體拮抗劑對H2O2誘導的HUVECs增殖率的影響：與正常對照組比較，H2O2對照組的HUVECs增殖率下降，差異具有顯著性(P=0.000)。LSD組間多重比較結果提示，與H2O2對照組比較，30nmol/L(生理濃度)睪酮干預組與300nmol/L、3nmol/L(稍高于或低于生理濃度)睪酮干預組的HUVECs

10、的增殖率都具有升高的趨勢(P=0.058，P=0.127，P=0.335)；3μmol/L(高于生理濃度)睪酮干預組卻具有相反的作用(P=0.000)。與30nmol/L睪酮干預組比較，先給予雌激素受體拮抗劑ICI182，780孵育，可以降低HUVECs的增殖率，差異具有顯著性(P=0.000)；而先給予雄激素受體拮抗劑氟他胺，卻可以升高HUVECs的增殖率，差異也具有顯著性(p=0.000)。 2、不同濃度睪酮及生理濃度睪酮合

11、用性激素受體拮抗劑對H2O2誘導的HUVECs的SA-B-gal陽性細胞百分率的影響：與正常對照組比較，H2O2對照組的HUVECs的SA-β-gal.染色陽性細胞百分率升高，差異具有顯著性(P=0.000)。LSO組間多重比較結果提示，與H2O2對照組比較，30nmol/L(生理濃度)睪酮干預組與300nmol/L、3nmol/L(稍高于或低于生理濃度)睪酮干預組的陽性細胞百分率都有降低的趨勢，P分別為0.094、0.115、0.46

12、4。與30nmol/L睪酮干預組比較，先給予雌激素受體拮抗劑ICI182，780預處理，陽性細胞百分率升高，差異具有顯著性(P=0.000)：而先給予雄激素受體拮抗劑氟他胺預處理，卻可以降低陽性細胞百分率，差異也具有顯著性(P=0.038)。 3、抗氧化劑、生理濃度睪酮及其合用性激素受體拮抗劑對H2O2誘導的HUVECs內ROS水平的影響：與正常對照組比較，H2O2對照組的HUVECs的相對DCF熒光強度增加，差異具有顯著性(P

13、=0.000)。LSD組間多重比較結果提示，與H2O2對照組比較，抗氧化劑NAC干預組的HUVECs的相對DCF熒光強度減弱，差異具有顯著性(P=0.000),30nmol/L睪酮干預組的HUVECs的相對DCF熒光強度也呈減弱趨勢，P=0.362。與30nmol/L睪酮干預組比較，予雌激素受體拮抗劑ICI182，780預處理，可以增強HUVECs的相對DCF熒光強度，差異具有顯著性(P=0.002),而先予雄激素受體拮抗劑氟他胺預處理

14、，可以減弱HUVECs的相對DCF熒光強度，差異也具有顯著性(P=0.004)。 4、抗氧化劑、生理濃度睪酮及其合用性激素受體拮抗劑對H2O2誘導的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表達的影響：與正常對照組比較，H2O2對照組的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表達量增加，差異具有顯著性(P=0.000)。LSD組間多重比較結果提示，與H2O2對照組比較，NAC干預組的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表達量減少，差異具有顯著性(P=0.0

15、00)；30nmol/L睪酮干預組的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表達量減少，P=0.132。與30nmol/L睪酮干預組比較，予雌激素受體拮抗劑ICI182，780預處理，細胞的去磷酸化Rb蛋白表達量增多，差異具有顯著性(P=0.000)；而予雄激素受體拮抗劑氟他胺預處理，細胞的去磷酸化Rb蛋白表達量表達量減少，差異也具有顯著性(P=0.000)。 結論： 通過本研究，我們能夠得出以下結論： 1、60μmol/

16、L的H2O2持續(xù)作用72h后，HUVECs細胞內活性氧水平增加，去磷酸化Rb蛋白表達增加，細胞增殖能力減弱，SA-β-gal染色陽性細胞百分率增加，細胞發(fā)生了衰老。提示ROS引起的氧化應激是HUVECs衰老的重要機制之一。 2、30nmol/L(生理濃度)睪酮與300nmol/L、3nmol/L(稍高于或低于生理濃度)睪酮都具有升高H2O2誘導的HUVECs的增殖率、降低SA-β-gal染色陽性細胞百分率的趨勢。3μmol/L(

17、高于生理濃度)睪酮卻具有相反的作用。提示睪酮對HUVECs衰老的干預作用與其濃度相關。 3、與30nmol/L睪酮干預組比較，先給予雌激素受體拮抗劑ICI182，780孵育，可以拮抗30nmol/L睪酮的干預作用，增加HUVECs細胞內ROS水平和去磷酸化Rb蛋白表達，降低H2O2誘導的HLJVECs的增殖率，升高SA-β-gal染色陽性細胞百分率；而先給予雄激素受體拮抗劑，卻具有相反的作用。提示生理濃度的睪酮或許能通過部分芳香