巴戟天糖鏈對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的作用研究.pdf

1、背景與目的:
　　 缺血性心臟病是心血管疾病的主要致死原因。目前雖然在心臟搭橋、冠脈支架技術(shù)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步和臨床應(yīng)用,但是由于患者個(gè)體的差異加之手術(shù)過(guò)程的復(fù)雜性和危險(xiǎn)性的限制,仍有相當(dāng)數(shù)量的患者不適于上述血管重建的方法。治療性血管新生即通過(guò)一些方法的刺激包括某些藥物的治療作用增加功能性的冠狀動(dòng)脈分支或側(cè)支循環(huán),達(dá)到恢復(fù)缺血心肌血供,改善患者癥狀和預(yù)后的目的。導(dǎo)師組以往對(duì)巴戟天糖鏈保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用進(jìn)行的研究結(jié)果證實(shí):巴戟天糖鏈

2、(MOO)可以顯著縮小心肌梗死面積,提高缺血心肌微血管密度,顯著誘導(dǎo)血管新生過(guò)程中VEGF蛋白、bFGF蛋白、Flt-1蛋白及PDGF-B蛋白的表達(dá),明顯的減輕缺氧復(fù)氧或缺血／再灌注對(duì)心肌的損傷,促進(jìn)雞胚絨毛尿囊血管生成作用。然而,對(duì)于巴戟天糖鏈的促血管新生作用及信號(hào)機(jī)制尚不明確。因此,本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)檢測(cè)巴戟天糖鏈在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)血管新生模型實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和管腔結(jié)構(gòu)數(shù)的影響以及巴戟天糖鏈對(duì)ERK1／2蛋白及其磷

3、酸化水平的影響,進(jìn)一步觀察巴戟天糖鏈促血管生成效應(yīng),并探討巴戟天糖鏈對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管發(fā)生過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,以為其在缺血心肌保護(hù)及促進(jìn)缺血心臟建立側(cè)枝循環(huán)方面的作用提供更加直觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,選取3-8代狀態(tài)良好的細(xì)胞,模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷,建立內(nèi)皮細(xì)胞體外缺氧復(fù)氧損傷(H／R)模型:采用氧清除劑連二亞硫酸鈉造成缺氧,種板培養(yǎng)24 h后,各孔棄去培養(yǎng)基,用無(wú)糖Earle's液

4、洗細(xì)胞2次,正常對(duì)照組加入1640培養(yǎng)基；模型組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1 mM的無(wú)糖Earle's液,造成細(xì)胞缺氧損傷,陽(yáng)性藥對(duì)照組加入麝香保心丸(2 g·L-1),MOO各組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1 mM的無(wú)糖Earle's液及MOO大(0.45g·L-1)、中(0.15 g·L-1)、小(0.05 g·L-1),37℃孵育4 h；取出培養(yǎng)板,吸棄各實(shí)驗(yàn)孔液體,用無(wú)糖Earle's液洗細(xì)胞2次,各實(shí)驗(yàn)孔均換含藥的無(wú)血清1640

5、培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)12 h,造成細(xì)胞復(fù)氧損傷。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分為六組:正常細(xì)胞組、H／R模型組、H／R+陽(yáng)性對(duì)照組(麝香保心丸2 g·L-1)、H／R+MOO大(0.45 g·L-1)、中(0.15 g·L-1)、小(0.05 g·L-1)劑量組。
　　 3.HUVEC細(xì)胞株接種于50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng),至第三代；將細(xì)胞分為6組,按上述分組情況分別加藥；24 h后倒置顯微

6、鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。流式細(xì)胞儀測(cè)量?jī)?nèi)皮細(xì)胞在H／R條件下的細(xì)胞周期變化。
　　 4.采用transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巴戟天糖鏈對(duì)體外內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用:HUVEC在缺氧4 h復(fù)氧12 h后收獲；24孔板每孔加入600μl正常培養(yǎng)基,放置小室；向小室中加入細(xì)胞懸液100μl(1×105·ml-1),模型組加入等量PBS,陽(yáng)性藥物組加入SBW,各給藥組加入大、中、小劑量的MOO。每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,37℃、5％CO2培養(yǎng)4 h

7、;去除濾膜上層細(xì)胞,95％乙醇固定后胎盤藍(lán)染色；顯微鏡下計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù),隨機(jī)選取8個(gè)視野。
　　 5.采用小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巴戟天糖鏈對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞形成管腔結(jié)構(gòu)的影響:HUVEC在缺氧復(fù)氧處理后收獲,制成2×104·ml-1細(xì)胞懸液；96孔板每孔加入50μl Matrigal,37℃、5％CO2條件下溫育4 h；每孔加入上述細(xì)胞懸液100μl,模型組加入等量PBS,陽(yáng)性對(duì)照組加入SBW,MOO各組分別加入大、中、小劑量的M

8、OO;每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。18 h后觀察各組細(xì)胞管狀排列狀況及管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量、完整程度,并隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照；應(yīng)用Image J軟件分析顯微鏡下每個(gè)視野總的小管面積數(shù)量,結(jié)果以與模型對(duì)照組相比的百分?jǐn)?shù)表示。
　　 6.收獲細(xì)胞,提取蛋白,采用蛋白印跡法檢測(cè)巴戟天糖鏈對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中ERK1／2及p-ERK1／2蛋白表達(dá)情況。
　　 7.計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件

9、SPSS12.0進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析,組間用LSD法進(jìn)行兩兩比較。取a=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài):正常培養(yǎng)的HUVEC,細(xì)胞核圓,核膜清晰,呈鋪路石樣單層生長(zhǎng)模式；經(jīng)歷缺氧復(fù)氧損傷處理后,細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷,細(xì)胞膜皺縮,細(xì)胞體積縮小,間隙變大,呈碎裂崩解壞死狀；陽(yáng)性藥物麝香保心丸組,胞膜不清,部分細(xì)胞凋亡；巴戟天糖鏈各劑量組對(duì)HUVEC細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型后的損傷均顯示出

10、不同程度的保護(hù)作用。
　　 2.流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常組相比,H／R模型組增加了G1期細(xì)胞比例,減少了(G2+S)期的細(xì)胞比例(P<0.05),巴戟天糖鏈大、中、小劑量組增加(G2+S)期的細(xì)胞比例,與H／R模型組相比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。巴戟天糖鏈各劑量組對(duì)HUVEC細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型后的損傷均顯示出不同程度的保護(hù)作用,并促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　 3.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:用巴戟天糖鏈處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)缺氧損

11、傷能夠抑制細(xì)胞遷移,而各劑量巴戟天藥劑都能夠促進(jìn)缺氧損傷條件下細(xì)胞遷移。與模型組相比,MOO各劑量組可明顯增加缺氧復(fù)氧損傷內(nèi)皮細(xì)胞的遷移數(shù)目(P<0.05)。
　　 4.小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:MOO大、中、小劑量組細(xì)胞培養(yǎng)6 h即可見(jiàn)有細(xì)胞間的相互連接形態(tài),18 h在martrigel表面形成完整的管腔樣結(jié)構(gòu),并隨著濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),管腔結(jié)構(gòu)增多。缺氧復(fù)氧損傷模型組細(xì)胞在18 h后才開始相互連接,24 h未能在基質(zhì)膠表

12、面形成完整的管腔樣結(jié)構(gòu),SBW組細(xì)胞狀態(tài)不好,未見(jiàn)有小管形成。經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像分析軟件處理得小管形成面積,結(jié)果以與模型組相比的百分?jǐn)?shù)表示。正常組與模型組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),模型組與給藥組差相比別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 5.Western-blotting結(jié)果顯示:Western-blotting檢測(cè)ERK1／2蛋白的表達(dá),各組蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異；檢測(cè)ERK1／2磷酸化水平,與正常組相比,模型組ERK1／

13、2的磷酸化水平明顯減少(P<0.05)；與模型組相比,巴戟天糖鏈藥物大、中劑量組ERK1／2的磷酸化水平顯著升高(P<0.05),巴戟天糖鏈對(duì)各組ERK1／2的磷酸化水平與用藥劑量正相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.巴戟天糖鏈可以顯著減輕H／R對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　 2.巴戟天糖鏈能有效促進(jìn)H／R損傷的內(nèi)皮細(xì)胞遷移和小管形成,促進(jìn)HUVEC的血管發(fā)生。
　　 3.ERK1／2蛋白的磷酸化