巴戟天糖鏈對人臍靜脈內(nèi)皮細胞血管新生的作用研究.pdf

1、背景與目的:
　　 缺血性心臟病是心血管疾病的主要致死原因。目前雖然在心臟搭橋、冠脈支架技術(shù)有了長足的進步和臨床應(yīng)用,但是由于患者個體的差異加之手術(shù)過程的復雜性和危險性的限制,仍有相當數(shù)量的患者不適于上述血管重建的方法。治療性血管新生即通過一些方法的刺激包括某些藥物的治療作用增加功能性的冠狀動脈分支或側(cè)支循環(huán),達到恢復缺血心肌血供,改善患者癥狀和預后的目的。導師組以往對巴戟天糖鏈保護心血管系統(tǒng)的作用進行的研究結(jié)果證實:巴戟天糖鏈

2、(MOO)可以顯著縮小心肌梗死面積,提高缺血心肌微血管密度,顯著誘導血管新生過程中VEGF蛋白、bFGF蛋白、Flt-1蛋白及PDGF-B蛋白的表達,明顯的減輕缺氧復氧或缺血／再灌注對心肌的損傷,促進雞胚絨毛尿囊血管生成作用。然而,對于巴戟天糖鏈的促血管新生作用及信號機制尚不明確。因此,本實驗將通過檢測巴戟天糖鏈在人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)血管新生模型實驗系統(tǒng)中對細胞增殖、遷移和管腔結(jié)構(gòu)數(shù)的影響以及巴戟天糖鏈對ERK1／2蛋白及其磷

3、酸化水平的影響,進一步觀察巴戟天糖鏈促血管生成效應(yīng),并探討巴戟天糖鏈對內(nèi)皮細胞血管發(fā)生過程中的信號轉(zhuǎn)導途徑,以為其在缺血心肌保護及促進缺血心臟建立側(cè)枝循環(huán)方面的作用提供更加直觀的實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞,選取3-8代狀態(tài)良好的細胞,模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷,建立內(nèi)皮細胞體外缺氧復氧損傷(H／R)模型:采用氧清除劑連二亞硫酸鈉造成缺氧,種板培養(yǎng)24 h后,各孔棄去培養(yǎng)基,用無糖Earle's液

4、洗細胞2次,正常對照組加入1640培養(yǎng)基；模型組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1 mM的無糖Earle's液,造成細胞缺氧損傷,陽性藥對照組加入麝香保心丸(2 g·L-1),MOO各組加入含連二亞硫酸鈉終濃度為1 mM的無糖Earle's液及MOO大(0.45g·L-1)、中(0.15 g·L-1)、小(0.05 g·L-1),37℃孵育4 h；取出培養(yǎng)板,吸棄各實驗孔液體,用無糖Earle's液洗細胞2次,各實驗孔均換含藥的無血清1640

5、培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)12 h,造成細胞復氧損傷。
　　 2.實驗分為六組:正常細胞組、H／R模型組、H／R+陽性對照組(麝香保心丸2 g·L-1)、H／R+MOO大(0.45 g·L-1)、中(0.15 g·L-1)、小(0.05 g·L-1)劑量組。
　　 3.HUVEC細胞株接種于50ml細胞培養(yǎng)瓶中,用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng),至第三代；將細胞分為6組,按上述分組情況分別加藥；24 h后倒置顯微

6、鏡觀察細胞生長狀態(tài)。流式細胞儀測量內(nèi)皮細胞在H／R條件下的細胞周期變化。
　　 4.采用transwell小室遷移實驗檢測巴戟天糖鏈對體外內(nèi)皮細胞的遷移作用:HUVEC在缺氧4 h復氧12 h后收獲；24孔板每孔加入600μl正常培養(yǎng)基,放置小室；向小室中加入細胞懸液100μl(1×105·ml-1),模型組加入等量PBS,陽性藥物組加入SBW,各給藥組加入大、中、小劑量的MOO。每組均設(shè)置3個復孔,37℃、5％CO2培養(yǎng)4 h

7、;去除濾膜上層細胞,95％乙醇固定后胎盤藍染色；顯微鏡下計數(shù)濾膜下表面的細胞數(shù),隨機選取8個視野。
　　 5.采用小管形成實驗檢測巴戟天糖鏈對內(nèi)皮細胞細胞形成管腔結(jié)構(gòu)的影響:HUVEC在缺氧復氧處理后收獲,制成2×104·ml-1細胞懸液；96孔板每孔加入50μl Matrigal,37℃、5％CO2條件下溫育4 h；每孔加入上述細胞懸液100μl,模型組加入等量PBS,陽性對照組加入SBW,MOO各組分別加入大、中、小劑量的M

8、OO;每組均設(shè)置3個復孔,37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。18 h后觀察各組細胞管狀排列狀況及管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量、完整程度,并隨機選取5個視野拍照；應(yīng)用Image J軟件分析顯微鏡下每個視野總的小管面積數(shù)量,結(jié)果以與模型對照組相比的百分數(shù)表示。
　　 6.收獲細胞,提取蛋白,采用蛋白印跡法檢測巴戟天糖鏈對內(nèi)皮細胞中ERK1／2及p-ERK1／2蛋白表達情況。
　　 7.計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((x)±s)表示,采用統(tǒng)計學軟件

9、SPSS12.0進行方差齊性檢驗、單因素方差分析,組間用LSD法進行兩兩比較。取a=0.05作為檢驗水準。
　　 結(jié)果:
　　 1.顯微鏡下觀察細胞形態(tài):正常培養(yǎng)的HUVEC,細胞核圓,核膜清晰,呈鋪路石樣單層生長模式；經(jīng)歷缺氧復氧損傷處理后,細胞出現(xiàn)明顯損傷,細胞膜皺縮,細胞體積縮小,間隙變大,呈碎裂崩解壞死狀；陽性藥物麝香保心丸組,胞膜不清,部分細胞凋亡；巴戟天糖鏈各劑量組對HUVEC細胞缺氧復氧模型后的損傷均顯示出

10、不同程度的保護作用。
　　 2.流式細胞檢測結(jié)果顯示:與正常組相比,H／R模型組增加了G1期細胞比例,減少了(G2+S)期的細胞比例(P<0.05),巴戟天糖鏈大、中、小劑量組增加(G2+S)期的細胞比例,與H／R模型組相比,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。巴戟天糖鏈各劑量組對HUVEC細胞缺氧復氧模型后的損傷均顯示出不同程度的保護作用,并促進細胞增殖。
　　 3.細胞遷移實驗結(jié)果顯示:用巴戟天糖鏈處理細胞后發(fā)現(xiàn)缺氧損

11、傷能夠抑制細胞遷移,而各劑量巴戟天藥劑都能夠促進缺氧損傷條件下細胞遷移。與模型組相比,MOO各劑量組可明顯增加缺氧復氧損傷內(nèi)皮細胞的遷移數(shù)目(P<0.05)。
　　 4.小管形成實驗結(jié)果顯示:MOO大、中、小劑量組細胞培養(yǎng)6 h即可見有細胞間的相互連接形態(tài),18 h在martrigel表面形成完整的管腔樣結(jié)構(gòu),并隨著濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長,管腔結(jié)構(gòu)增多。缺氧復氧損傷模型組細胞在18 h后才開始相互連接,24 h未能在基質(zhì)膠表

12、面形成完整的管腔樣結(jié)構(gòu),SBW組細胞狀態(tài)不好,未見有小管形成。經(jīng)計算機圖像分析軟件處理得小管形成面積,結(jié)果以與模型組相比的百分數(shù)表示。正常組與模型組差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05),模型組與給藥組差相比別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 5.Western-blotting結(jié)果顯示:Western-blotting檢測ERK1／2蛋白的表達,各組蛋白表達量無明顯差異；檢測ERK1／2磷酸化水平,與正常組相比,模型組ERK1／

13、2的磷酸化水平明顯減少(P<0.05)；與模型組相比,巴戟天糖鏈藥物大、中劑量組ERK1／2的磷酸化水平顯著升高(P<0.05),巴戟天糖鏈對各組ERK1／2的磷酸化水平與用藥劑量正相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.巴戟天糖鏈可以顯著減輕H／R對血管內(nèi)皮細胞的損傷,促進細胞增殖。
　　 2.巴戟天糖鏈能有效促進H／R損傷的內(nèi)皮細胞遷移和小管形成,促進HUVEC的血管發(fā)生。
　　 3.ERK1／2蛋白的磷酸化