人臍靜脈內(nèi)皮細胞構(gòu)建血管化組織工程真皮的研究.pdf

1、自體皮片移植是治療皮膚創(chuàng)傷的傳統(tǒng)方法，但自體皮源不足是大面積創(chuàng)傷救治過程中的難題。除自體皮片移植以外，組織工程皮膚為治療皮膚損傷提供了一種來源充足而有效的治療方法。目前已研制了多種組織工程真皮產(chǎn)品且部分商品經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)用于臨床。2007年11月第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院組織工程實驗中心研究開發(fā)的組織工程皮膚產(chǎn)品通過國家鑒定，成為我國第一個組織工程產(chǎn)品，現(xiàn)已應(yīng)用于臨床治療，為臨床的各種皮膚損傷提供了足夠的可供移植的皮膚來源。然而由于目前組

2、織工程皮膚產(chǎn)品缺乏血管結(jié)構(gòu)，移植后無法為組織工程真皮種子細胞的分裂、增殖提供充足的營養(yǎng)和氧氣，即充足的血液供應(yīng)。使其在面積較大和深度皮膚損傷的移植成功率和修復(fù)效果受到一定的影響。所以提高組織工程真皮的血管化對改善其移植成活率及修復(fù)效果具有重要的意義。
　　本研究從構(gòu)建組織工程所用的種子細胞、支架材料和緩釋系統(tǒng)等方面出發(fā)對組織工程真皮的血管化問題進行了一定的研究。實驗分四部分進行，具體內(nèi)容如下：
　　1．作為血管化組織工程真皮

3、種子細胞人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)及鑒定
　　酶消化法獲得人臍靜脈內(nèi)皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)種子細胞，通過倒置相差顯微鏡，免疫熒光組織化學(xué)檢測第VIII因子相關(guān)抗原的表達、掃描電子顯微鏡觀察細胞表面結(jié)構(gòu)及其排列方式和透射電子顯微鏡觀察Weibel-Palade小體進行細胞鑒定，結(jié)果顯示通過本實驗方法所獲得的細胞為純度較高，生長狀態(tài)良好的HUVEC。
　　2．新生小牛

4、皮I型膠原復(fù)合HUVEC和成纖維細胞構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮的研究
　　通過種子細胞HUVEC和人皮膚成纖維細胞(fibroblast,Fb)的接觸和非接觸共培養(yǎng)，在二維和三維維條件下探討Fb對HUVEC形成血管的作用，構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮。
　　將獲得的HUVEC細胞傳代培養(yǎng)至第3代作為實驗細胞，應(yīng)用插入式培養(yǎng)皿進行HUVEC與Fb非接觸培養(yǎng)，同時用Hoechst33342標(biāo)記HUVEC后與Fb按不同比例混合進

5、行二維接觸培養(yǎng)，相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察。
　　將第3代HUVEC與Fb按1:1比例混合后復(fù)合膠原（細胞密度106/ml）進行三維培養(yǎng)，構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮，HE染色觀察。HUVEC與混合后復(fù)合膠原（細胞密度106/ml）進行三維培養(yǎng)構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮，HE染色觀察。實驗結(jié)果表明在二維和三維條件下Fb均可促進HUVEC形成血管樣結(jié)構(gòu),本實驗成功構(gòu)建出含血管樣結(jié)構(gòu)的組織工程真皮。
　　3．豬脫細胞真皮基質(zhì)復(fù)

6、合HUVEC構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮的研究
　　通過改良方法制備高空隙率豬脫細胞真皮基質(zhì)(Acellulardermalmatrix,ADM)，將其作為組織工程真皮支架材料復(fù)合HUVEC和Fb進行體外培養(yǎng)，探討作為組織工程支架材料的ADM在構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮的作用及應(yīng)用。
　　利用改良的胰酶-膠原酶雙重消化法制備高空隙率ADM，通過HE染色、掃描電鏡和強度測試儀對ADM進行觀察測定，結(jié)果顯示ADM具有較高空隙率

7、和較大的斷裂強度。
　　ADM分別復(fù)合Fb和HUVEC進行共培養(yǎng)測定ADM的細胞相容性，同時將HUVEC（106/ml）注入ADM大空隙中體外培養(yǎng)，通過HE染色和掃描電鏡進行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果顯示以ADM為支架材料復(fù)合HUVEC可體外構(gòu)建含有血管樣結(jié)構(gòu)的組織工程真皮。
　　動物體內(nèi)實驗以無細胞ADM作為對照組，復(fù)合HUVEC的ADM作為實驗組進行裸鼠皮下移植實驗，HE染色結(jié)果顯示移植后2W，無血管形成，移植后3W，對照組無血管

8、形成，而實驗組有大量血管樣結(jié)構(gòu)形成，抗人CD31單克隆體和Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色為陽性，表明在體外由ADM復(fù)合HUVEC構(gòu)建的是含血管樣結(jié)構(gòu)的組織工程真皮，動物體內(nèi)移植后參與血管形成，提高組織工程真皮移植后血管形成速度，進而提高移植后的成功率。
　　4．明膠緩釋微球系統(tǒng)促進組織工程皮膚血管化的研究
　　細胞因子堿性纖維細胞生長因子（bisicfiberoblastgrowthfactor,bFGF）在血管發(fā)生和再生過程中

9、發(fā)揮非常重要的作用，在適當(dāng)?shù)臐舛认驴梢源龠M新生血管的生長。在體外構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)組織工程真皮，由于培養(yǎng)液為間斷性定期更換，難以維持培養(yǎng)液中和組織工程真皮深部bFGF濃度的穩(wěn)定。為了保證培養(yǎng)液中bFGF濃度的穩(wěn)定，本實驗利用明膠微球緩釋系統(tǒng)復(fù)合bFGF，通過明膠微球的緩釋作用維持培養(yǎng)液中bFGF濃度的恒定。
　　通過HUVEC和Fb與明膠微球共培養(yǎng)檢測明膠微球的生物相容性，體外溶出度測定方法測定明膠微球緩釋曲線，利用復(fù)合bFGF的明

10、膠微球混合膠原纖維作為組織工程真皮支架材料，以HUVEC作為種子細胞，F(xiàn)AD培養(yǎng)液體外共培養(yǎng)構(gòu)建含血管樣結(jié)構(gòu)的組織工程真皮；在其他條件相同的情況下，使用未復(fù)合bFGF明膠微球和加入50ng/ml濃度bFGF的FAD培養(yǎng)液作為對照構(gòu)建組織工程真皮，實驗結(jié)果顯示5d實驗組有血管樣結(jié)構(gòu)形成，而對照組很少有血管樣結(jié)構(gòu)形成。本實驗提示通過明膠微球復(fù)合生長因子可以提高HUVEC形成血管速度，為組織工程組織體內(nèi)移植提高血管再生和長入速度，進而提高移植