內(nèi)皮細胞和成骨細胞共培養(yǎng)構建血管化組織工程骨的研究.pdf

1、目的:
　　 1.體外原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，EC)，培養(yǎng)人成骨細胞(Osteoblasts，OB)，按照內(nèi)皮細胞:成骨細胞分別為1:0、8:1、4:1、1:1、1:4、1:8、0:1在24孔板中進行共培養(yǎng)。觀察不同比例下內(nèi)皮細胞和成骨細胞共培養(yǎng)對其成血管和成骨作用的影響。
　　 2.通過燒結法和凍干法制作CS/HA三維多孔支架，并對其細胞相容性及毒

2、性進行研究。為下一部分的體內(nèi)實驗提供實驗基礎。
　　 3.探討大鼠BMSCs來源的成骨細胞和內(nèi)皮細胞復合殼聚糖-羥基磷灰石多孔支架植入大鼠橈骨缺損處，觀察其成骨作用和成血管作用。
　　 方法:
　　 1.無菌環(huán)境下取本院新生兒臍帶25cm，并經(jīng)由新生兒家屬同意。在止血鉗內(nèi)側用碘酒和酒精棉球消毒后，用無菌剪刀將兩端臍帶剪除。在臍帶一端找到靜脈，插入臍帶靜脈插管，用2根粗絲線扎牢，用含有雙抗的PBS沖洗靜脈腔，直到?jīng)_

3、洗液無色清涼時。趕出靜脈腔內(nèi)殘余液體，將臍帶另一端用止血鉗夾閉，用10ml注射器連接針頭，注入37℃預熱的0.1％Ⅰ型膠原酶約8ml，放入37℃緩沖液中保溫10min。每隔5分鐘，輕輕搖動一次，以促使其充分消化。消化完畢后，用手輕輕揉擠臍靜脈，吸出靜脈腔內(nèi)Ⅰ型膠原酶所消化的細胞懸液，加入預加有緩沖液的離心管中，沖洗靜脈腔，一并加入離心管中。離心1500rpm，10min棄上清，用7ml10％胎牛血清，高糖DMED（100U/mL青霉素+

4、鏈霉素，50μg/mL維生素C）重懸細胞，轉入培養(yǎng)瓶，放5％CO2孵箱培養(yǎng)。第二天換液，用PBS輕輕洗一遍，去除紅細胞和未貼壁的細胞，每隔2-3天換液一次，7-10天可見細胞長滿瓶底。按照1:2的比例消化傳代。采用倒置顯微鏡每日觀察細胞生長狀態(tài)變化。人第Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學檢測來對原代分離培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞進行鑒定。人成骨細胞株MG63購自中科院上海細胞庫，在37℃水浴下迅速復蘇后，用含10％胎牛血清的高糖DMED(100U/

5、mL青霉素+鏈霉素，50μg/mL維生素C)進行培養(yǎng)，37℃、5％CO2，飽和濕度。平均2天換液一次，待細胞長滿瓶底進行1:2傳代。傳代時采用0.25％胰蛋白酶消化。對培養(yǎng)的成骨細胞每日均在顯微鏡下觀察，了解細胞貼壁，生長及形態(tài)變化等特點。繪制內(nèi)皮細胞和成骨細胞生長曲線。將人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人成骨細胞細胞按照單純內(nèi)皮細胞、8:1、4:1、1:1、1:4、1:8、單純成骨細胞的比例進行混合作為實驗組，人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人成骨細胞到分別單純

6、單層培養(yǎng)作為對照組。在第21天時采用細胞茜素紅鈣染色試劑盒進行染色，來觀察鈣化情況。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測各組VEGF表達水平。在第7、14、21天時將共培養(yǎng)各組每孔中的培養(yǎng)液收集，按照堿性磷酸酶檢測試劑盒說明書進行檢測，來觀察各組堿性磷酸酶含量。來綜合研究不同比例共培養(yǎng)對其成骨和成血管作用的差別。
　　 2.HA三維多孔支架經(jīng)燒結法制作而成，且購自于四川大學。稱取CS粉末，將其溶于醋酸，制成3％(w/v)的溶液，

7、再加入適量聚乙二醇后，1500rpm/min離心10分鐘。將HA支架先放入自制的模具中，將CS溶液攪拌均勻并無氣泡后，倒入模具中成型。然后將其放入-20℃冷凍2小時。再將其放入冷凍干燥機中，進行凍干16小時。水分被低溫升華后，CS/HA多孔支架即可制備好。用PBS反復沖洗支架，以中和支架內(nèi)參與的醋酸。采用乙醇置換法測定支架的孔隙率和密度。取1月齡雄性SD大鼠，斷頸處死后75％乙醇浸泡5min，無菌條件下取兩側脛骨和股骨。清理骨組織表面的

8、肌肉等軟組織，剝除骨膜以及干骺端軟骨層。用剪刀小心剪開兩端干骺端，用低糖DMEM培養(yǎng)基（300U/mL青霉素+鏈霉素）反復沖洗骨髓腔，將沖洗出來的骨髓懸液離心10min1500rpm/miin，棄上清后加入低糖DMEM培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液，以5×106個細胞/每T175培養(yǎng)瓶中，放入5％CO2細胞培養(yǎng)箱，37℃下培養(yǎng)，2天后首次換液，之后每3天換液一次。待BMSCs長滿瓶底90％時，按照1:2進行傳代培養(yǎng)，細胞傳至第3代時備用。采用

9、倒置顯微鏡每日觀察細胞生長狀態(tài)變化。將制備的CS/HA三維多孔支架事先用環(huán)氧乙烷消毒。收集第3代BMSCs，制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×107個/mL，將細胞接種于支架中，培養(yǎng)7天后，采用掃描電鏡觀察細胞在支架上的生長狀況。采用MTT法觀察CS/HA三維多孔支架浸提液對BMSCs生長的影響。
　　 3.1月齡SD雄性大鼠8只，體重90-110g;2月齡雄性SD大鼠30只，體重200-220g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

10、分離和培養(yǎng)方法參見方法2。將生長良好的第3代BMSCs加入含LG-DMEM培養(yǎng)基、10％胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、50μg/ml維生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的成骨誘導培養(yǎng)液中。每3d更換培養(yǎng)液1次。取誘導培養(yǎng)7天之后的成骨細胞置于放有無菌蓋玻片的24孔板中，行ALP染色鑒定。將生長良好的第3代BMSCs加入含LG-DMEM培養(yǎng)基、10％胎牛血清、2μg/LbFGF、10μg/mlVEGF的內(nèi)皮細胞誘導培養(yǎng)液中，每

11、3天更換培養(yǎng)液1次。取誘導培養(yǎng)14天后的內(nèi)皮細胞進行CD34和CD31免疫細胞化學染色鑒定。殼聚糖-羥基磷灰石多孔支架第二部分實驗已經(jīng)制作完畢，環(huán)氧乙烷消毒后使用。收集誘導7天的成骨細胞和誘導14天的內(nèi)皮細胞，用含10％胎牛血清的LG-DMEM制成5×106/ml細胞懸液。分組如下，2月齡雄性SD大鼠30只，隨機分成3組，每組10只，A組:單純EC-支架復合物;B組:單純OB-支架復合物;C組:OB-EC-支架復合物(1:1)。按照細胞

12、懸液反復滴加的方法，將單純EC、單純OB、OB-EC細胞均勻分布于殼聚糖-羥基磷灰石多孔支架上，將細胞支架復合物放置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育3小時后，待細胞粘附于支架表面后，加入含10％胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)液，2天換液一次，在體外培養(yǎng)7天后植入大鼠橈骨骨缺損模型的缺損部位。MTT測定支架內(nèi)細胞增殖情況。取2月齡雄性SD大鼠，3％戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉后，取仰臥位，常規(guī)脫毛，消毒，切開皮膚分離肌肉，暴漏橈骨中段，用手術剪剪

13、出5mm長的骨缺損。將30只大鼠平均分為3組，每組10只。將A，B，C三組的細胞支架復合物植入大鼠橈骨缺損處，逐層縫合傷口。移植術后第4、8、12周時，取出植入物，4％甲醛固定，EDTA脫鈣，酒精逐級脫水，包蠟，做石蠟切片，行HE染色、免疫組化法檢測CD34表達。采用CD34免疫組化染色法來計算移植物內(nèi)微血管數(shù)量。顯微鏡下找到血管密度高的區(qū)域，在200倍鏡下計數(shù)5個視野的微血管數(shù)量，取其平均值作為移植物微血管密度。采用實時定量PCR法檢

14、測各組移植物內(nèi)OPG(osteoprotegerin，OPG)、OPN基因表達情況。
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析，采用均數(shù)±標準差形式表示，組間比較采用析因設計的方差分析，兩兩比較采用LSD法，P值＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.內(nèi)皮細胞和成骨細胞均成功培養(yǎng)。人臍靜脈內(nèi)皮細胞接種2小時，開始貼壁，最初表現(xiàn)為多角形扁平樣，后慢慢變成長梭形，有些細胞排列成渦旋狀。7-10天后

15、長成單層，呈單層鋪路石狀排列。成骨細胞在接種的8h左右，細胞開始貼壁。剛貼壁的細胞形態(tài)多樣，而且無排列規(guī)律。細胞最初呈梭型，多有突起。細胞核偏向一側，且成卵圓形，胞漿較多。經(jīng)免疫細胞化學法鑒定的內(nèi)皮細胞陽性率高達98.4％。共培養(yǎng)各組細胞在21天中生長良好，第14天EC∶OB/1:8組可見成骨細胞開始集落式生長，并與內(nèi)皮細胞界限清楚。第21天EC∶OB/1:4組鈣化染色結節(jié)要明顯強于EC∶OB/1:8組，而單純OB組并未出現(xiàn)鈣化結節(jié)。E

16、C∶OB/1:4組堿性磷酸酶含量在三個時間點均明顯增高(P＜0.05)。單純EC組細胞分泌的堿性磷酸酶含量在三個時間點均較其他組處于最低。在EC∶OB為8:1、4:1、1:1的三個組，三個時間點均未檢測到VEGF的表達。在EC∶OB為1:4的組，第7天時VEGF開始增高，直到第21天時達到高峰。
　　 2.CS/HA支架經(jīng)凍干法成功制得。大鼠BMSCs成功分離及培養(yǎng)。BMSCs原代細胞接種后觀察可有少量圓形細胞逐漸貼壁。48h貼

17、壁細胞增多。細胞核呈圓形或橢圓形，胞核較大，胞漿豐富。培養(yǎng)72h后BMSCs開始分裂，形成細胞集落，培養(yǎng)10天左右開始融合。傳代至第4代時，仍可見細胞生長旺盛，增殖活力強。乙醇置換法測得支架的孔隙率約為90.1±3.6％，支架密度為0.085±0.013g/cm3。掃描電鏡可見CS/HA支架內(nèi)遍布大小均一的孔，孔徑為150-300μm，平均250μm?？梢钥吹郊毎^好的粘附于支架表面。也提示CS/HA支架生物相容性較好。MTT法檢測原培

18、養(yǎng)液組、浸提液組、1/2浸提液組細胞活力，發(fā)現(xiàn)三組在三個時間點細胞活力沒有顯著差異(P＞0.05)。揭示支架浸提液對細胞活性無影響。CS/HA支架對細胞無毒害。
　　 3.大鼠BMSCs成功分離培養(yǎng)。第三代BMSCs經(jīng)成骨誘導7天后，ALP染色后，細胞漿內(nèi)可見藍染顆粒，細胞核染成紅色。第三代BMSCs經(jīng)內(nèi)皮細胞誘導14天后，CD34免疫細胞化學染色呈陽性，細胞內(nèi)可見棕色染色顆粒。MTT結果顯示三組OD值隨著時間的延長，逐漸升高。

19、B組三個時間點的微血管密度均明顯低于其他兩組。隨著時間的延長，A組和C組的微血管密度明顯升高，到第12周時，微血管密度分別為36.35±5.41、32.37±4.08(P＜0.05)。術后12周，HE染色顯示A組未見明顯的類骨質形成，而有較密集的微血管結構，并且有較多的纖維組織形成。B組和C組可見均質的類骨質，呈條索狀和島狀分布?？梢姶罅砍晒菢蛹毎嬖凇組三個時間點OPN和OPG表達水平較低，第12周時，B組和C組OPN表達分別為GA

20、PDH的3.8和4.2倍。第4周時，B組和C組OPG表達分別為GAPDH的3.2和2.7倍。
　　 結論:
　　 1.內(nèi)皮細胞和成骨細胞共培養(yǎng)比例為4:1時，成血管作用較強，而比例為1:4時成骨作用更強。
　　 2.CS/HA三維多孔支架生物相容性較好，細胞毒性低，是一種較為理想的骨組織工程三維支架。
　　 3.BMSCs源性的成骨細胞和內(nèi)皮細胞按照1:1的比例共培養(yǎng)于殼聚糖-羥基磷灰石多孔支架作為組織工