同種異基因成骨細(xì)胞組織工程骨移植修復(fù)兔橈骨骨缺損免疫反應(yīng)的初步研究.pdf

1、目的:
　　探討由骨髓間充干細(xì)胞誘導(dǎo)而成的成骨細(xì)胞，體外對同種異基因T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)及由該種成骨細(xì)胞與羥基磷灰石-磷酸三鈣構(gòu)建的工程化骨，移植修復(fù)同種異基因兔橈骨骨缺損免疫反應(yīng)來探討同種異基因組織工程骨的免疫性，為同種異基因成骨細(xì)胞構(gòu)建工程骨移植修復(fù)骨缺損提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取與鑒定
　　取中國家兔骨髓，密度梯度離心法并結(jié)合貼壁傳代分離、獲取、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察細(xì)胞形

2、態(tài)和檢測表面標(biāo)志物的表達(dá)，MTT法測定第3代細(xì)胞的增殖情況，并繪制出生長曲線，并進(jìn)行成脂肪誘導(dǎo)油紅O染色鑒定。
　　2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)的研究
　　取生長良好的傳三代細(xì)胞，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察細(xì)胞形態(tài)，并分別于培養(yǎng)的第2天、第5天、第8天、第11天、第14天收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶含量測定;于誘導(dǎo)7天時(shí)行Ⅰ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色，于誘導(dǎo)14天行骨鈣素免疫細(xì)胞化學(xué)染色，于誘導(dǎo)21天時(shí)行鈣化結(jié)節(jié)染色同時(shí)用

3、掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和基質(zhì)分泌。
　　3、成骨細(xì)胞對混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中同種異基因T細(xì)胞亞群的免疫調(diào)節(jié)
　　取新西蘭白兔外周靜脈血，密度梯度離心法和尼龍毛柱法分離、獲取、純化，培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞，并檢測其濃度。以中國家兔成骨細(xì)胞為刺激細(xì)胞，新西蘭兔T細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞建立混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系，MTT法測定T細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞凋亡。
　　4、同種異基因組織工程骨的構(gòu)建
　　取中國家兔成骨細(xì)胞接種在HA-TCP

4、支架材料上，接種后第4、8、12、24小時(shí)取樣測定細(xì)胞的粘附率;熒光顯微鏡觀察成骨細(xì)胞在HA-TCP表面生長情況;復(fù)合培養(yǎng)3周后，取材行掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的生長增殖和基質(zhì)分泌情況，RT-PCR檢測Ⅰ型膠原表達(dá)。
　　5、異基因組織工程骨移植修復(fù)骨缺損免疫初步研究
　　(1)分別將組織工程骨(TEB、Ⅰ組)，單純HA-TCP(Ⅱ組)，自體骨(Ⅲ組)分別隨機(jī)植入兔橈骨骨缺損處，常規(guī)喂養(yǎng)，觀察各組動(dòng)物全身及骨缺損傷口局部情

5、況。
　　(2)術(shù)后6周，行X線片檢查，觀察橈骨骨缺損處骨愈合情況，各組植入物與宿主骨缺損處骨質(zhì)愈合大體情況以及超微結(jié)構(gòu)變化情況。
　　(3)術(shù)后4天，10天，6周分別測定脾重指數(shù)，EDU細(xì)胞染色觀察脾內(nèi)細(xì)胞增殖情況;HE染色觀察脾大體病理變化，透射電鏡觀察淋巴細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化;ELISA檢測脾臟內(nèi)細(xì)胞IFN-γ，IL-10表達(dá)水平;RT-PCR檢測脾內(nèi)細(xì)胞IFN-γmRNA、IL-10mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:

6、
　　1、經(jīng)密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離、純化所獲得到的細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形，接近融合狀態(tài)時(shí)可呈現(xiàn)旋渦樣生長，細(xì)胞增殖檢測曲線顯示細(xì)胞自我增殖、更新能力強(qiáng);所分離的細(xì)胞表達(dá)CD44、CD105，僅約2％表達(dá)CD34，成脂肪誘導(dǎo)油紅染色陽性。
　　2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)由長梭形逐漸變?yōu)槎趟笮?，多角形，最后成集落層疊生長;在誘導(dǎo)過程中，ALP含量逐漸增高，與對照組比較有顯著性差異(p＜0.01);于誘導(dǎo)7天時(shí)Ⅰ

7、型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色，誘導(dǎo)14天骨鈣素免疫細(xì)胞化學(xué)染色，誘導(dǎo)21天時(shí)鈣化結(jié)節(jié)染色陽性;掃描電鏡顯示細(xì)胞生長旺盛，并分泌基質(zhì)。
　　3、細(xì)胞接種4h，8h，12h，24h，36h細(xì)胞粘附率分別為44±1.5％，68±1.3％，78±1.0％，84±2.0％，87±1.8％。36h后，每塊HA-TCP材料上細(xì)胞粘附率均達(dá)85％以上，培養(yǎng)3周后，熒光顯微鏡和掃描電鏡均顯示，成骨細(xì)胞在HA-TCP材料表面生長旺盛，形態(tài)良好，并長入支架材

8、料孔隙中，并有基質(zhì)分泌。
　　4、各組動(dòng)物術(shù)后傷口愈合良好，局部炎癥反應(yīng)輕，無滲出。6周后，X線顯示Ⅰ組中TEB與宿主骨結(jié)合處基本愈合，而Ⅱ組中HA-TCP與宿主骨愈合不滿意，Ⅲ組中骨缺損處骨質(zhì)愈合。三組骨缺損骨質(zhì)愈合情況:Ⅲ組＞Ⅰ組＞Ⅱ組。透射電鏡顯示三組骨缺損處成骨細(xì)胞突入膠原纖維間，成纖纖維，膠原纖維豐富;三組比較:Ⅰ組成纖纖維，膠原纖維豐富;而Ⅱ組成纖纖維，膠原纖維相對較少;Ⅲ組成纖纖維，膠原纖維最豐富。
　　5、術(shù)

9、后4天，10天，6周各時(shí)間點(diǎn)各組動(dòng)物脾指數(shù)脾重量指數(shù)同組前后比較，前期稍高，后期稍低，但三組間比較，p＞0.05;HE染色可見各時(shí)間點(diǎn)脾形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，脾小結(jié)大小均勻，紅髓、白髓無明顯差異;只是早期紅髓血管稍擴(kuò)張、充血，但白髓無明顯擴(kuò)大，脾小結(jié)淋巴細(xì)胞稍多;形態(tài)無明顯改變。后期紅髓形態(tài)恢復(fù)正常，脾小結(jié)淋巴細(xì)胞較早期減少。脾內(nèi)細(xì)胞增殖同組前后比較，前期稍高，后期稍低，但三組間比較，p＞0.05;電鏡顯示，Ⅲ組淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，Ⅰ組與Ⅱ組

10、淋巴細(xì)胞線粒體均不同程度的出現(xiàn)線粒體空泡化、嵴斷裂、紊亂、腫脹、凝集;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、間隙增寬脫顆粒;染色質(zhì)濃縮、邊集，染色體疏松等，高爾基復(fù)合體和各級溶酶體明顯增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯脫顆粒，Ⅰ組較Ⅱ組明顯。術(shù)后4天，10天，6周脾內(nèi)細(xì)胞IFN-γ、IL-10水平及IFN-γmRNA、IL-10mRN表達(dá)，同組前后比較，前期稍高，后期稍低，P＞0.05;三組相比較P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各時(shí)間點(diǎn)相比較p＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　

11、　結(jié)論:
　　1、采用密度梯度離心法結(jié)合細(xì)胞貼壁法分離BMSCs方法操作簡單、易行，分離出的BMSCs純度高，保持旺盛的增殖能力;在體外可誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞，擴(kuò)增迅速，性狀穩(wěn)定，符合組織工程種子細(xì)胞的基本條件。
　　2、由BMSCs體外誘導(dǎo)成的成骨細(xì)胞有一定免疫原性，但極低，可以抑制異基因T細(xì)胞增殖，推測其可能促使CD8+細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　3、由同種異基因BMSCs誘導(dǎo)成的成骨細(xì)胞與HA-TCP材料體外構(gòu)建組織工程骨