兔骨髓單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞促組織工程骨支架血管化研究.pdf

1、組織工程技術(shù)為解決大段骨缺損治療中移植骨來(lái)源的難題帶來(lái)了希望。骨組織工程研究在種子細(xì)胞、支架材料、細(xì)胞因子、培養(yǎng)條件等方面已取得階段性成果，但目前構(gòu)建的組織工程骨因缺乏有效的早期快速血管化措施，植入體內(nèi)后種子細(xì)胞不能及時(shí)獲得足夠的氧和營(yíng)養(yǎng)，從而導(dǎo)致再生組織生長(zhǎng)速度過(guò)慢、新生組織質(zhì)量缺陷，因此，組織工程化骨的快速血管化問(wèn)題成為當(dāng)前的研究重點(diǎn)。研究表明，從骨髓分離、獲取的單個(gè)核細(xì)胞在體外適宜的誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)后能表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞表型。這種由骨

2、髓單個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)而來(lái)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，在一定條件下可以促進(jìn)組織的血管生成。脫鈣骨基質(zhì)由于具有天然的三維空間結(jié)構(gòu)、良好的生物相容性和力學(xué)性能，是目前骨組織工程較為理想的支架材料，已用于骨組織工程實(shí)驗(yàn)研究及臨床?；谏鲜龇治觯狙芯繑M對(duì)骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離、誘導(dǎo)培養(yǎng)，以獲取足量具有血管內(nèi)皮細(xì)胞表型的細(xì)胞；然后，采用纖維蛋白凝膠接種技術(shù)將其接種到脫鈣骨基質(zhì)支架上，并進(jìn)行體外培養(yǎng)使其預(yù)先血管化；進(jìn)一步將體外血管化的細(xì)胞-支架復(fù)合體移植入動(dòng)物

3、大段骨缺損區(qū)域進(jìn)行原位觀察，通過(guò)影像學(xué)及組織化學(xué)等相關(guān)方法檢測(cè)上述體外血管化的工程化骨支架的在體血管生成能力。 目的： 1．分離、獲取兔骨髓單個(gè)核細(xì)胞，條件培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)使其具有血管內(nèi)皮表型；科學(xué)的計(jì)量分析并觀察其體外培養(yǎng)的主要生物學(xué)特點(diǎn)，獲取足量具備血管發(fā)生功能的血管內(nèi)皮細(xì)胞； 2．采用纖維蛋白凝膠接種技術(shù)構(gòu)建兔骨髓單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞及脫鈣骨基質(zhì)支架復(fù)合物，體外培養(yǎng)使其預(yù)先血管化，同時(shí)觀察纖維蛋白凝膠對(duì)骨

4、髓來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖的影響； 3．將體外制備并預(yù)先血管化的細(xì)胞-支架復(fù)合體自體移植到兔尺骨大段骨缺損區(qū)域，在體觀察其成血管能力。 方法： 1．兔骨髓經(jīng)梯度離心后分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，采用特定誘導(dǎo)培養(yǎng)液(EGM-2培養(yǎng)液)促使原代培養(yǎng)細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞表型分化，計(jì)量分析12d細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量，并對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，指標(biāo)為：細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、DiI-acLDL攝取實(shí)驗(yàn)、UEA結(jié)合實(shí)驗(yàn)、CD31和vWF免疫組織化學(xué)染色。

5、 2．消化、收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的第二代內(nèi)皮細(xì)胞，以1×10<'6>密度接種于纖維蛋白凝膠中，并定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；利用MTT法繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，切片作HE染色。采用纖維蛋白凝膠接種技術(shù)，將第二代誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞以1×10<'7>/ml濃度種于脫鈣骨基質(zhì)支架，體外培養(yǎng)并定期觀察其在支架內(nèi)的生長(zhǎng)情況，6d后行電鏡觀察，切片作HE染色。 3．建立兔尺骨大段骨缺損動(dòng)物模型，并按以下分組進(jìn)行體內(nèi)成血管實(shí)驗(yàn)研究。①空白組：不進(jìn)行植入；②對(duì)照組

6、：生物蛋白凝膠+支架；③實(shí)驗(yàn)組：誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞+生物蛋白凝膠+支架復(fù)合物。每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6例標(biāo)本。分別于2，4，8w拍X片，行墨汁灌注，切片HE染色，Brdu免疫熒光，CD31和Brdu免疫組織化學(xué)染色并計(jì)算微血管密度。 結(jié)果： 1．細(xì)胞接種后24h可觀察到明顯的細(xì)胞集落形成，細(xì)胞集落成典型中央小圓形細(xì)胞周?chē)趟笮渭?xì)胞放射生長(zhǎng)，4d集落開(kāi)始從外圍散開(kāi)。1ml骨髓經(jīng)本誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng)處理后，傳代培養(yǎng)12-14d后收獲細(xì)胞(3.06

7、±0.42)×10M<'6>個(gè)。誘導(dǎo)細(xì)胞呈單層鋪路石樣生長(zhǎng)，可攝取低密度脂蛋白、可結(jié)合凝集素、陽(yáng)性表達(dá)CD31和vwF抗原。 2．兔MNCs誘導(dǎo)培養(yǎng)的第二代細(xì)胞在纖維蛋白凝膠內(nèi)培養(yǎng)1d后細(xì)胞開(kāi)始變形，3d后梭形鋪開(kāi)，6d后細(xì)胞間形成連接，細(xì)胞在纖維蛋白凝膠內(nèi)生長(zhǎng)曲線(xiàn)成“S”形，切片HE染色示細(xì)胞生長(zhǎng)良好。兔MNCs誘導(dǎo)培養(yǎng)的第二代內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)纖維蛋白凝膠接種在支架內(nèi)培養(yǎng)1d后細(xì)胞開(kāi)始變形，3d后梭形鋪開(kāi)，6d后細(xì)胞間形成連接，電

8、鏡檢查支架空隙內(nèi)可見(jiàn)類(lèi)似內(nèi)皮樣結(jié)構(gòu)。 3．X線(xiàn)、大體標(biāo)本及HE染色示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組骨痂生成更規(guī)則完整，而空白組未見(jiàn)明顯骨缺損修復(fù)；實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組和空白組4w及8w時(shí)墨汁灌注示血管更豐富；切片CD31組織化學(xué)染色并計(jì)算微血管密度，2，4，8w實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組新生骨組織中微血管密度均更高，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有明顯差異(P<0.01)；Brdu熒光和免疫組織化學(xué)染色顯示標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞參與血管形成。 結(jié)論 1．骨髓經(jīng)Percoll分

9、離液梯度離心獲取的骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)EGM-2培養(yǎng)液誘導(dǎo)可以分化為具有特定表型、增殖能力較強(qiáng)的足量的內(nèi)皮細(xì)胞表型的細(xì)胞。 2．兔骨髓單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞在纖維蛋白凝膠內(nèi)生長(zhǎng)增殖良好，纖維蛋白凝膠可以作為其接種載體。 3．采用纖維蛋白凝膠雙相接種的兔骨髓單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞-脫鈣骨基質(zhì)支架復(fù)合物內(nèi)植入細(xì)胞分布均勻，體外培養(yǎng)6d可見(jiàn)類(lèi)似內(nèi)皮樣結(jié)構(gòu)形成，證實(shí)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞能通過(guò)體外培養(yǎng)將脫鈣骨基質(zhì)支架進(jìn)行初步血管化。