巴戟天糖鏈對(duì)血管新生中Notch信號(hào)通路的作用研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　 缺血再灌注損傷(ischemia/rcperfusion injury)是臨床上冠心病人常見(jiàn)的一種嚴(yán)重心肌損傷。如何減輕心肌缺血再灌注損傷,恢復(fù)心肌供血,保護(hù)心肌細(xì)胞成為治療冠心病的關(guān)鍵。治療性血管新生(therapeutic angiogensis)指通過(guò)適當(dāng)干預(yù),增加功能性血管分支及側(cè)支循環(huán)開放,以恢復(fù)缺血再灌注損傷后缺血心肌供血,達(dá)到改善/治療冠心病目的。近年來(lái),本導(dǎo)師組一直致力于巴戟天糖鏈促進(jìn)治療

2、性血管新生的作用及機(jī)制研究,并證實(shí)巴戟天糖鏈可促進(jìn)雞胚絨毛尿囊血管生成作用、增加MVD的數(shù)量:提高乳鼠缺血心肌微血管密度,誘導(dǎo)與血管新生相關(guān)的PDGF-β、TRPC6、VEGF、ERK1/2、bFGE等促進(jìn)血管新生蛋白表達(dá),促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和分化,促進(jìn)缺氧復(fù)氧損傷后內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管管腔樣結(jié)構(gòu)生成等。巴戟天糖鏈促進(jìn)血管新生的機(jī)制較為復(fù)雜,因此,本課題將通過(guò)觀察巴戟天糖鏈對(duì)缺氧復(fù)氧損傷后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通

3、路中Notch1,Jagged1的蛋白表達(dá),探討巴戟天糖鏈在促進(jìn)血管生成過(guò)程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的潛在機(jī)制并提供理論支持。
　　 方法:
　　 1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧復(fù)氧損傷模型制備與確定
　　 將HUVEC細(xì)胞接種到75ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),給予含10％新生牛血清的RPMI1640高糖培養(yǎng)基,37℃,5%CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取3～7代生長(zhǎng)狀態(tài)良好,長(zhǎng)滿80%左右的細(xì)胞,加入5ml缺氧液并不間斷通入95%N2,5

4、%CO2混合氣體,造成缺氧損傷。1h后將缺氧液吸去,用室溫PBS清洗一遍,加入5ml復(fù)氧液并置于3712,5%CO2,飽和濕度培養(yǎng)箱中,造成復(fù)氧損傷。2h后將復(fù)氧液棄去,加入室溫PBS清洗一遍后,分別加入經(jīng)過(guò)不同處理培養(yǎng)基,繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),24h后顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。
　　 2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分6組(1)正常細(xì)胞組(2)缺氧復(fù)氧損傷模型組(3)缺氧復(fù)氧損傷模型+麝香保心丸藥液組(陽(yáng)性藥物對(duì)照組)2g/L(4)缺氧復(fù)氧損傷模型

5、+MOO小劑量組50mg/L(5)缺氧復(fù)氧損傷模型+MOO中劑量組150mg,L(6)缺氧復(fù)氧損傷模型+MOO大劑量組450mg/L
　　 3檢測(cè)方法(1)采用免疫組化SP法定性檢測(cè)Notch通路蛋白表達(dá)情況。(2)采用Western-Bloting蛋白印跡法定量測(cè)定各組Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)變化。
　　 4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用SPSS17.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。檢驗(yàn)結(jié)果均取α

6、=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。組間比較采用單因素方差分析,當(dāng)差異有顯著差異時(shí)進(jìn)一步用LSD法進(jìn)行兩兩比較。
　　 結(jié)果：
　　 1、倒置顯微鏡下可見(jiàn)正常HUVEC,胞核圓,胞膜清晰,多邊梭形,鋪路石樣。損傷后細(xì)胞收縮變圓,形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞間隙變大并出現(xiàn)部分脫落。24h后,各給藥組細(xì)胞均出現(xiàn)增殖,以MOO各組呈劑量依賴性的更為顯著。
　　 2、免疫組化SP法檢測(cè)結(jié)果顯示:Notch信號(hào)通路的主要信號(hào)分子Notchl和Ja

7、gged均在胞膜和胞漿中表達(dá),除正常組呈弱陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)外,其余各組均呈陽(yáng)性表達(dá)信號(hào);模型組與正常組相比光密度值顯著升高(p＜0.05);與模型組相比,各用藥劑量組Notchl、Jaggedl光密度值均顯著降低(P＜0.05);MOO3個(gè)劑量組之間光密度值均有顯著差異。
　　 3、Western-Bloting蛋白印跡法檢測(cè)N0tch1和Jagged1蛋白結(jié)果顯示:模型組與正常組相比,蛋白表達(dá)量明顯上升(P＜0.05);與模型組相