Notch信號通路在內(nèi)耳干細胞增殖分化中的作用.pdf

1、第一部分、小鼠內(nèi)耳干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　 目的：建立小鼠內(nèi)耳干細胞體外培養(yǎng)的模型。
　　 方法：取剛出生的小鼠耳蝸基底膜，體外于無Ca、Mg的D-Hanks溶液中進行分離，單細胞懸液置于含有2％B27、1％N2、50ng/mlIGF-1、20ng/ml EGF、10ng/ml bFGF的DMEM∶F12(1∶1)培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。用Abcg2、Brdu免疫熒光法鑒定內(nèi)耳干細胞。
　　 結(jié)果：所取的小鼠耳蝸

2、基底膜單細胞可形成集落樣生長的內(nèi)耳干細胞球，Abcg2、Brdu免疫細胞化學(xué)染色陽性。
　　 結(jié)論：新生小鼠基底膜可以體外誘導(dǎo)出表達干細胞標記的球體，具有自我更新能力，可能為內(nèi)耳干細胞。
　　 第二部分、Notch信號對內(nèi)耳干細胞增殖及干性維持的調(diào)節(jié)
　　 目的：探討Notch信號通路對內(nèi)耳干細胞增殖的影響以及對干細胞干性的維持。
　　 方法：內(nèi)耳干細胞培養(yǎng)，一組加含DMSO的培養(yǎng)基，一組加含DAPT的培

3、養(yǎng)基，觀察兩組球體的數(shù)量、大小，用Brdu、Active-notch1、Myosin7a免疫熒光法觀察兩組細胞表達的差異。
　　 結(jié)果：球體增殖期有Active-notch1的表達，DMSO組干細胞球體數(shù)量與DAPT組無差別，球體體積DMSO組比DAPT組大，DMSO組Brdu陽性細胞數(shù)較DAPT組明顯增多，DAPT組表達myosin7a，DMSO組不表達myosin7a。
　　 結(jié)論：notch信號通路的活化抑制內(nèi)耳干

4、細胞球體的增殖，維持內(nèi)耳干細胞的干性。
　　 第三部分、Notch信號對內(nèi)耳干細胞分化的作用
　　 目的：探討notch信號通路對內(nèi)耳干細胞分化的影響。
　　 方法：內(nèi)耳干細胞無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)7天后，收集接種蓋玻片上進行貼壁分化，分為兩組，一組加含DMSO的分化培養(yǎng)基，一組加含DAPT的分化培養(yǎng)基，分化7天后，用myosin7a、P27kip1、F-actin免疫熒光法觀察兩組細胞表達的差異。
　　 結(jié)果