Notch信號在內(nèi)皮細胞促進造血干細胞增殖中作用的研究.pdf

1、目的：
　　骨髓移植是目前許多血液系統(tǒng)疾病唯一可治愈的治療策略，但如何在體外有效擴增數(shù)量有限的造血干細胞(HSC)仍然是當今的研究熱點及難點，近年來的研究已經(jīng)證實了Notch信號和內(nèi)皮細胞(ECs)在維持HSC池穩(wěn)態(tài)和再生中的重要作用，同時我們之前的研究已表明在體外培養(yǎng)中ECs可促進HSCs增殖。本試驗將更深入地探討ECs促進HSCs增殖是否和Notch信號相關(guān)，為體外有效擴增HSCs的深入研究提供理論依據(jù)。
　　方法：

2、r>　?、偻ㄟ^膠原酶消化分離小鼠肺組織，獲得的細胞采用EC培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時觀察細胞的形態(tài)，通過免疫熒光染色和流式細胞術(shù)鑒定ECs的特性及純度，當細胞融合至80％左右進行細胞傳代培養(yǎng)和共培養(yǎng)。②取得的小鼠骨髓通過密度梯度離心法以得到單個核細胞(MNC)，采用免疫磁珠分選儀分選出CD117+HSC細胞，采取流式細胞儀測定CD117陽性細胞的純度及HSCCD117CD34的共表達率。③將HSC接種到含或未含ECs的培養(yǎng)基中，分為EC單獨培養(yǎng)組

3、、EC+HSC共培養(yǎng)組、HSC單獨培養(yǎng)組，每組設(shè)置3個復孔，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)ECs促進HSC增殖于第4天作用最明顯，于第7天HSC峰值最高，因此將第4天和第7天作為本實驗的時間點。培養(yǎng)第4天和第7天分別采集ECs和HSC樣本，通過熒光定量PCR(qRT-PCR)測定ECs和HSC表面Notch配體、受體及下游靶基因的表達及其表達是否發(fā)生改變。
　　結(jié)果：
　　①小鼠肺微血管經(jīng)膠原酶消化后，4天時細胞貼壁，大多細胞呈圓形，部

4、分細胞呈串珠樣結(jié)構(gòu)相連;培養(yǎng)至第8天，可見細胞聚集成團，大多細胞成短梭形及不規(guī)則形，相鄰細胞伸出偽足與彼此相連;10天時，可觀察到細胞開始表現(xiàn)出“鵝卵石樣”形態(tài)，細胞融合達70-80％;培養(yǎng)至第14天，細胞逐漸增多，排列緊密，細胞融合達到90％，表現(xiàn)為典型的“鵝卵石樣”形態(tài);FACS鑒定ECs，實驗結(jié)果表明：vWF、CD31、CD34、CD45表達率分別為：81.39％、45.8％、57.48％、0.17％。免疫熒光染色和共聚焦成像結(jié)果

5、表明：CD31陽性率為54.5％。②應(yīng)用免疫磁珠分選儀分選的CD117+細胞，存活率為97％，鏡下細胞較小，呈圓形;FACS鑒定HSC，實驗結(jié)果表明CD117+細胞的純度為99.51％，HSC CD117CD34共表達率為75.28％。③分別統(tǒng)計EC+HSC組、HSC組的第4天及第7天的HSC數(shù)量，HSC的計數(shù)EC+HSC組均高于HSC單獨培養(yǎng)組（P＜0.05），各組中HSC計數(shù)第7天＞第4天(P＜0.05)。④培養(yǎng)第4天及第7天，通過

6、RNA提取試劑盒提取HSCRNA，EC+HSC組HSC的RNA含量均高于HSC單獨培養(yǎng)組（P＜0.05），各組中HSC的RNA含量第7天＞第4天（P＜0.05）;⑤培養(yǎng)第4天及第7天，用熒光定量PCR法分別檢測EC的Jagged-2和HSC的Notch1、Notch2、Hes-1的相對表達量，即RQ值。在第4天和第7天中Jagged-2的RQ值：EC+HSC組均高于EC單獨培養(yǎng)組（P＜0.05）;各組中ECs的Jagged-2第7天均高

7、于第4天（P＞0.05）。在第4天和第7天中Notch1的RQ值：EC+HSC組均高于HSC單獨培養(yǎng)組（P＜0.05）;在第4天和第7天中Notch2的RQ值：EC+HSC組均高于HSC單獨培養(yǎng)組（P＜0.05）;在第4天和第7天中Hes-1的RQ值：EC+HSC組均高于HSC單獨培養(yǎng)組（P＜0.05）;且在EC+HSC共培養(yǎng)組中HSC中的Notch1、Notch2、Hes-1在第7天均高于第4天（P＜0.05）。
　　結(jié)論：