人羊膜來源干細胞促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移及血管生成機制探究.pdf

1、目的:動脈粥樣硬化是一種慢性進展的炎性疾病，由內(nèi)皮損傷、炎性細胞浸潤、脂質(zhì)代謝紊亂、神經(jīng)血管功能失調(diào)等原因引起，給人民健康帶來很大威脅。目前被普遍接受的“損傷反應”學說認為，動脈粥樣硬化與血管內(nèi)皮細胞之間關系密切，血管內(nèi)皮細胞襯在血管內(nèi)壁，為血流提供光滑的表面，并作為半透膜，將血管內(nèi)外分開，起屏障作用，內(nèi)皮細胞功能性的損傷是動脈粥樣硬化形成早期的始動環(huán)節(jié)。粥樣斑塊破裂常導致急性心肌梗死，造成心肌永久損傷，若血管內(nèi)皮細胞可以迅速反應，通過

2、血管生成作用促進側(cè)枝循環(huán)，可以部分恢復局部缺血心肌血供，繼而促進心梗后心功能的恢復。因此，在心血管疾病中，血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移及血管生成能力至關重要。hAECs和hAMSCs通過促進內(nèi)皮細胞存活、保護已有血管的穩(wěn)定作用和促進缺血組織的血管再生在各種細胞治療中發(fā)揮作用。干細胞發(fā)揮作用的機制尚不明確，其中旁分泌作用機制引起我們的關注，間充質(zhì)干細胞旁分泌產(chǎn)生許多生長因子，如肝細胞生長因子(HGF)，表皮生長因子(EGF)，肝素結(jié)合的EGF樣

3、生長因子(HBEGF)，胰島素生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)，與內(nèi)皮細胞的血管發(fā)生密切相關，而羊膜上皮細胞相關研究有限。本研究的目的是:1），從人羊膜分離和鑒定人羊膜間充質(zhì)干細胞及人羊膜上皮細胞;2）研究這些細胞條件培養(yǎng)液對內(nèi)皮細胞功能影響;3)，通過RNA-seq對比人羊膜來源的兩種細胞生長因子在mRNA水平差異;4）深入探究上皮細胞旁分泌作用相關的生長因子。
　　研究方法:入主動脈內(nèi)皮細胞(hAoECs)從Sciencell（美國）

4、購買，P4-6被用于細胞實驗。羊膜組織通過酶消化法原代提取獲得間充質(zhì)干細胞和上皮細胞兩類細胞，并通過流式細胞方法、細胞免疫熒光及細胞分化能力進行鑒定。分別從hAoECs、hAECs及hAMSCs收集條件培養(yǎng)基(CdM)，用于培養(yǎng)hAoECs，實驗分組情況為CdM-hAoEC（對照），CdM-hAEC、CdM-hAMSC及EGM-2(陽性對照)。我們使用細胞劃痕實驗及Transwell小室實驗，以評估主動脈內(nèi)皮細胞遷移能力;細胞增殖試劑盒

5、(CCK-8)和細胞周期檢測來評估主動脈內(nèi)皮細胞增殖能力;細胞實驗基質(zhì)膠血管生成及實驗小鼠體內(nèi)基質(zhì)膠栓塞實驗以評估血管生成的能力。為了檢測血管生成相關基因的表達，我們對羊膜來源兩種細胞進行了Illumina HiseqTM2500轉(zhuǎn)錄組測序，以FC＞2及P＜0.05篩選差異表達基因，通過Gene Otology數(shù)據(jù)庫對測序結(jié)果分析，以期尋找關鍵的旁分泌生長因子，并通過qRT-PCR對測序結(jié)果進行mRNA水平驗證，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(E

6、LISA)檢測收集的條件培養(yǎng)液中生長因子濃度;為了進一步探究羊膜上皮細胞旁分泌作用中發(fā)揮重要作用的生長因子，我們選擇差異表達明顯，并已有商品化中和抗體的肝素樣表皮生長因子(HBEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子A(TGFA)、表皮調(diào)節(jié)素(EREG)進行研究，通過抗體特異性的中和條件培養(yǎng)液的相應因子，觀察其在促進主動脈內(nèi)皮細胞遷移及成管中的作用。
　　結(jié)果:原代提取得到的上皮細胞，呈多角形，長滿后呈上皮細胞特有的鋪路石樣外觀，間充質(zhì)細胞傳至3代

7、以后細胞呈成纖維樣形態(tài)、魚群狀分布。經(jīng)流式細胞術(shù)，hAEC: CD90(+)、CD44(+)、CD29(+)、CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)、CD45(-)、CD49d(-)、CD31(-) HLA-DR(-)、SOX-2(+)、OCT3/4(+)、SSEA-4(+),hAMSC: CD90(+)、CD44(+)、CD29(+)、CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)、CD45(-)、CD49d(+)、 CD

8、31（-）HLA-DR(-)、SOX-2(+)、OCT3/4(+)、SSEA-4(+);細胞免疫熒光結(jié)果顯示:上皮細胞表達CK19，而間充質(zhì)干細胞不表達CK19，hAECs和hAMSCs均表達干細胞標記物SSEA-4、Oct-4和SOX-2。人羊膜來源兩種細胞均可向成骨細胞、成脂細胞及成軟骨細胞分化。收集羊膜來源細胞條件培養(yǎng)液(CdM)，觀察CdM對內(nèi)皮細胞生物學功能的影響。通過劃痕實驗及transwell實驗檢測條件培養(yǎng)液對內(nèi)皮細胞遷

9、移能力的影響，劃痕實驗通過IPP軟件進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示與CdM hAoEC相比(20.11±7.04％)，CdM hAEC(75.86±3.06％)明顯促進內(nèi)皮細胞向劃痕區(qū)域遷移，而CdMhAMSC（29.16±5.12％）促進遷移作用不明顯;為了進一步驗證條件培養(yǎng)液對內(nèi)皮細胞遷移的影響，我們將內(nèi)皮細胞置于上室，將不同條件培養(yǎng)液置于下室，觀察條件培養(yǎng)液對內(nèi)皮細胞遷移的趨化作用，結(jié)果與劃痕實驗結(jié)果相似，CdM hAEC明顯促進內(nèi)皮細胞遷移

10、(184.01±33.66 CdM-hAEC vs.58.82±23.99 CdM-hAMSC;p＜0.05，45.20±30.04 CdM-hAoEC);通過CCK-8及細胞周期檢測條件培養(yǎng)液對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響，CCK-8實驗表明，與CdM hAoEC及陽性對照EGM-2相比，CdM hAMSC明顯促進內(nèi)皮細胞增殖，而CdM hAEC促進增殖作用不明顯;我們用流式細胞周期檢測進行驗證，與CCK-8實驗結(jié)果相似，間充質(zhì)干細胞條件培

11、養(yǎng)液培養(yǎng)主動脈內(nèi)皮細胞后，內(nèi)皮細胞S期所占比例明顯提高(30.56±1.91％ CdM-hAMSCvs.21.61±1.54％ CdM-hAoEC)，而CdM hAEC促進增殖作用不明顯;血管生成相關細胞實驗及動物實驗均表明從hAECs和hAMSCs獲得的條件培養(yǎng)液維持內(nèi)皮細胞生成血管的穩(wěn)定性。我們通過轉(zhuǎn)錄組測序探究可能的旁分泌生長因子，測序數(shù)據(jù)初步分析得到4152個差異表達基因，將這些差異基因進行Gene Ontology(GO)分析

12、，挑選出可能旁分泌的差異基因，通過qPCR及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進一步驗證測序結(jié)果，表明羊膜間充質(zhì)干細胞分泌較多的血管生成相關因子HGF、bFGF等，羊膜上皮細胞分泌IHBEGF、TGFA、EREG水平較高。我們深入研究羊膜上皮細胞旁分泌生長因子對hAoEC遷移及血管生成的影響。使用不同濃度梯度的中和抗體進行transwell實驗，最終選定0.5ug/ml中和抗體濃度繼續(xù)后續(xù)試驗，實驗結(jié)果表明，單獨加入TGFA或EREG中和抗

13、體后，可抑制hAoEC遷移，而HBEGF中和抗體對hAoEC遷移影響不大，同時使用三種中和抗體對CdM-hAEC進行中和后，抑制hAoEC遷移作用明顯。通過中和抗體中和人羊膜上皮細胞條件培養(yǎng)液，觀察CdM-hAEC對hAoEC成管的改變，結(jié)果表明，同時使用三種中和抗體對CdM-hAEC進行中和后，明顯抑制hAoEC成管作用。
　　結(jié)論:1）通過流式細胞鑒定及細胞分化能力鑒定，我們成功提取了人羊膜上皮細胞及人羊膜間充質(zhì)干細胞;羊膜來

14、源兩種細胞條件培養(yǎng)液均能影響內(nèi)皮細胞功能，從hAECs獲得的條件培養(yǎng)液促進主動脈內(nèi)皮細胞遷移;從hAMSCs獲得的條件培養(yǎng)液促進主動脈內(nèi)皮細胞增殖;從hAECs和hAMSCs獲得的條件培養(yǎng)液維持內(nèi)皮細胞生成血管的穩(wěn)定性;2）轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明人羊膜上皮細胞和間充質(zhì)干細胞均表達多種生長因子，如EGF、HBEGF、VEGFA、bFGF、HGF，TGFA、EREG和IGF-1，qRT-PCR及ELISA進一步驗證人羊膜來源兩種細胞可旁分泌多種