乳腺癌干細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞參與腫瘤血管形成.pdf

1、腫瘤干細(xì)胞(Cancerstemcells，CSCs)是腫瘤細(xì)胞中表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的亞群，具有高增殖能力和多向分化潛能。血管新生是許多腫瘤轉(zhuǎn)移的先兆，與腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入血液循環(huán)發(fā)生轉(zhuǎn)移同時(shí)發(fā)生。研究表明，腫瘤干細(xì)胞能參與腫瘤血管的生成，多種細(xì)胞表面受體、生長(zhǎng)因子和酶參與其中。已有研究證實(shí)在腦膠質(zhì)瘤中存在腫瘤干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞參與腫瘤血管的形成。本實(shí)驗(yàn)旨在研究是否存在乳腺癌干細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞參與腫瘤血管的形成。
　　目的:證實(shí)

2、乳腺癌干細(xì)胞具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化的能力，并且該部分細(xì)胞能參與腫瘤血管的形成。
　　方法:收集人乳腺癌標(biāo)本，一部分標(biāo)本制備成組織切片后，首先采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤血管中P53、CD31、VEGF、HER-2的表達(dá)，然后采用免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測(cè)腫瘤血管中CD31和HER-2的共表達(dá)，并用激光共聚焦顯微鏡證實(shí)，HER-2的表達(dá)進(jìn)一步采用熒光原位雜交方法證實(shí)其擴(kuò)增。另一部分標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞消化制備單細(xì)胞懸液，然后采用免疫磁珠分選(MACS

3、)方法從中分選CD44+/CD24-/low細(xì)胞，分選得到的細(xì)胞接種至含有20μg/LEGF、20μg/LbFGF、2％B27的DMEM/F12干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)1-2w后收集乳腺球細(xì)胞，用0.25％胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液后，以105/ml接種至纖粘蛋白包被的六孔板，培養(yǎng)體系為EGM-2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。六孔板長(zhǎng)滿后進(jìn)行消化傳代后接種至25cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)細(xì)胞采用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)其內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志CD31和CD1

4、05的表達(dá)和攝取乙?；兔芏戎鞍?Ac-LDL)的能力，并在體外進(jìn)行三維膠培養(yǎng)，觀察其脈管樣結(jié)構(gòu)形成。
　　結(jié)果:乳腺癌標(biāo)本石蠟切片中均可觀察到CD31、VEGF、突變型P53、HER-2的表達(dá)，并沿著血管腔或血管球排列。激光共聚焦顯微鏡下可觀察到乳腺癌血管中CD31和HER-2同時(shí)表達(dá)。熒光原位雜交技術(shù)可在乳腺癌組織中檢測(cè)到HER-2擴(kuò)增。分離的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行免疫磁珠分選，分選前細(xì)胞中CD44+細(xì)胞比例為7.1％±2.9％，經(jīng)

5、免疫磁珠分選后細(xì)胞中，CD44+細(xì)胞為94.5％±5.1％，最高達(dá)99.9％;分選前細(xì)胞中CD24+細(xì)胞比例為43.6％±9.7％，經(jīng)免疫磁珠分選后CD24+細(xì)胞比例為3.7％±0.9％，CD24+細(xì)胞比例越低，則CD24-/low細(xì)胞比例越高，即CD24-/low細(xì)胞最高達(dá)95％。CD44+/CD24-/low經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)后，能形成乳腺球。將乳腺球細(xì)胞消化后經(jīng)EGM-2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)后收集P1代細(xì)胞行流式檢測(cè)，乳腺球細(xì)胞

6、中CD105+細(xì)胞比例為4.8％±0.6％、CD31+細(xì)胞比例為0.5％±0.2％，經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)后的P1代細(xì)胞中，CD105+和CD31+細(xì)胞率分別為42.1％±7.8％和92.1％±4.7％。最高達(dá)49.1％和97.4％。且培養(yǎng)后的細(xì)胞能攝取DiI-Ac-LDL,同時(shí)培養(yǎng)后的細(xì)胞通過三維膠培養(yǎng)能形成脈管樣結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論:
　　1)乳腺癌組織中部分血管內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞具有同源性。
　　2)乳腺癌細(xì)胞能分離