乳腺癌干細(xì)胞在三陰乳腺癌EMT發(fā)生和血管生成擬態(tài)形成中的作用.pdf

1、研究背景和目的：
　　三陰乳腺癌是乳腺癌的特殊的分子類型，其特點(diǎn)為腫瘤中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體2（HER-2）均不表達(dá)，因缺乏有效的治療靶點(diǎn)，三陰乳腺癌患者的預(yù)后很差。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞在三陰乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[1,2]。
　　腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)是存在于腫瘤細(xì)胞中的一種特殊的亞群細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞數(shù)量稀少，并且具有自我更新

2、以及多向分化的能力，研究證實(shí)腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的形成和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，并影響患者的預(yù)后[3-5]。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤干細(xì)胞與腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生和血管生成擬態(tài)的形成存在密切的聯(lián)系[6]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是機(jī)體正常胚胎發(fā)育及腫瘤轉(zhuǎn)移中重要的過程；腫瘤血管擬態(tài)（vasculogenic mimicry,VM）是近年發(fā)現(xiàn)的特殊腫瘤血液微循環(huán)模式，VM不

3、依賴內(nèi)皮細(xì)胞，其管腔由腫瘤細(xì)胞圍成，并可以在管腔中發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞，VM和腫瘤的惡性程度以及轉(zhuǎn)移具有緊密的聯(lián)系。在本課題中我們通過研究腫瘤干細(xì)胞在三陰乳腺癌EMT的發(fā)生及VM形成中的機(jī)制，從而為三陰乳腺癌的治療尋找新的思路。
　　研究方法：
　　一、研究人三陰乳腺癌中腫瘤干細(xì)胞同VM的關(guān)系。
　　收集天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)院總醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除并且隨訪資料完整的100例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌病理資料100例，以腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、C

4、D24、VM相關(guān)蛋白VE-cadherin為指標(biāo)，對乳腺癌病理組織切片行免疫組織化學(xué)染色，并進(jìn)行CD31/PAS雙重染色，觀察并分析含有腫瘤干細(xì)胞特異性指標(biāo)CD44+和CD24—表型的乳腺癌干細(xì)胞和患者年齡、腫瘤分級、腫瘤大小、TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移狀況、預(yù)后、是否為三陰乳腺癌、VE-cadherin蛋白表達(dá)以及和VM的相關(guān)性。
　　二、腫瘤干細(xì)胞對三陰乳腺癌EMT發(fā)生和VM形成影響的體外研究
　　1）常規(guī)培養(yǎng)三陰乳腺癌細(xì)胞系

5、MDA-MB-231和非三陰乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，檢測MDA-MB-231和MCF-7在管道結(jié)構(gòu)形成能力、遷移和侵襲能力的差異，使用westernblot實(shí)驗(yàn)檢測其EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的差異；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1+和CD133+表型細(xì)胞的含量，并在MDA-MB-231細(xì)胞中分選出帶有ALDH1+及ALDH1-表型的細(xì)胞。下文分別將ALDH1+表型的MDA-MB-231細(xì)胞和A

6、LDH1-表型的MDA-MB-231簡稱為ALDH1+231和ALDH1-231。
　　2）將分選出的ALDH1+231和ALDH1-231細(xì)胞進(jìn)行低吸附無血清成球培養(yǎng)，觀察ALDH1+231和ALDH1-231細(xì)胞體外成球能力的差異。
　　3）利用遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察ALDH1+231及ALDH1-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力的差異。
　　4)利用三維培養(yǎng)分析ALDH1+231及ALDH1-231細(xì)胞管道結(jié)構(gòu)形成能力的差

7、異。
　　5)利用Western blot檢測ALDH1+231及ALDH1-231細(xì)胞中ALDH1的表達(dá)和EMT相關(guān)蛋白 Twist1，E-cadherin，VM相關(guān)蛋白 VE-cadherin的表達(dá)差異。
　　三、TA2小鼠高轉(zhuǎn)移乳腺癌中腫瘤干細(xì)胞對EMT發(fā)生、VM形成及生物學(xué)行為的影響
　　1）選取天津醫(yī)科大學(xué)動物房培育的自發(fā)三陰乳腺癌TA2小鼠高轉(zhuǎn)移乳腺癌組織，將腫瘤組織研磨成單細(xì)胞懸液，使用流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤

8、組織中具有腫瘤干細(xì)胞特異性分子標(biāo)記物ALDH+和CD133+的腫瘤干細(xì)胞含量。
　　2）在本部分實(shí)驗(yàn)中，使用ALDH1作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物分選后的乳腺癌細(xì)胞記為ALDH1+細(xì)胞和ALDH1-細(xì)胞，使用CD133作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物分選后的乳腺癌細(xì)胞記為CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞。分別將分選后的ALDH1+及ALDH1-、CD133+及CD133-共4組腫瘤細(xì)胞按照不同細(xì)胞量接種于TA2小鼠，觀察腫瘤干細(xì)胞對TA2小鼠乳腺癌

9、生物學(xué)行為的影響。
　　3）將 TA2小鼠腫瘤組織制成組織切片，進(jìn)行 ALDH1、CD133、VE-cadherin、E-cadherin、Twsit1和endomucin/PAS雙重染色，觀察腫瘤干細(xì)胞對EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Twsit1、VM形成相關(guān)蛋白VE-cadherin的影響以及對VM形成的作用。
　　研究結(jié)果：
　　一、在三陰乳腺癌中 CD44表達(dá)高于非三陰乳腺癌，CD44陽性患者預(yù)后較差，

10、CD44表達(dá)與VE-cadherin表達(dá)以及VM呈正相關(guān)，CD24表達(dá)與VM呈負(fù)相關(guān)。
　　免疫組化結(jié)果顯示:在100例乳腺癌病例中，包括CD44陽性病例56例(56％)，CD44陰性病例44例(44%)，在三陰乳腺癌組織中CD44表達(dá)高于非三陰乳腺癌患者（χ2=5.884，P=0.016），VM陽性患者中CD44表達(dá)明顯升高（χ2=3.89，P=0.049）。通過對TNM分期比較，在Ⅲ、Ⅳ期病人的癌組織中CD44表達(dá)比Ⅰ，Ⅱ期病

11、人要高（χ2=3.89， P=0.049）, VE-caderin免疫組化結(jié)果顯示，CD44陽性表達(dá)的病例中，VE-cadherin要高于CD44陰性表達(dá)病例（χ2=4.127，P=0.042）。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，CD44陽性患者組比CD44陰性患者組的生存時間短（χ2=4.307，P=0.038）。CD44的表達(dá)在患者年齡、分級、腫瘤大小、以及是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異中沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。CD24陽

12、性病例占66例（66%），陰性病例占34例（34%），對比CD24陽性和CD24陰性病例發(fā)現(xiàn)，VM與CD24表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（χ2=4.397，P=0.036）,其他相關(guān)數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　二、三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231乳腺癌干細(xì)胞含量高于非三陰乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中的含量。ALDH1+231細(xì)胞在體外成球能力、侵襲和遷移能力、形成管道的能力均高于ALDH1-231的細(xì)胞，并且細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)較高。

13、　　1）三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的體外形成管道、遷移、侵襲能力以及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)高于非三陰乳腺癌細(xì)胞MCF-7。
　　2）流式細(xì)胞術(shù)分選結(jié)果證實(shí)，在MDA-MB-231中ALDH1+表型細(xì)胞的表達(dá)占26.87%，CD133+表型細(xì)胞占8.75%。MCF-7細(xì)胞系中ALDH1+表型細(xì)胞占3.4%，CD133+表型細(xì)胞占1.27%。
　　3）遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與ALDH1-231細(xì)胞相比，ALDH1+231的

14、細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯增強(qiáng)。
　　4）三維培養(yǎng)結(jié)果顯示，ALDH1+231細(xì)胞的管狀結(jié)構(gòu)形成能力明顯強(qiáng)于ALDH1-231細(xì)胞。
　　5） Westernblot結(jié)果顯示，ALDH1+231細(xì)胞的VE-cadherin蛋白,Twist1蛋白表達(dá)高于ALDH1-231組，E-cadherin蛋白表達(dá)低于ALDH1-231組。
　　三、TA2高轉(zhuǎn)移三陰乳腺癌組織中存在腫瘤干細(xì)胞，ALDH1+和CD133+表型的腫瘤干細(xì)胞具

15、有較強(qiáng)的腫瘤生長能力，并影響EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)并促進(jìn)VM的形成。
　　1）在TA2高轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中ALDH1+細(xì)胞占31.2%，CD133+細(xì)胞占6.5%。
　　2） ALDH1+組小鼠的腫瘤生長速度明顯高于ALDH1-組小鼠。CD133+組小鼠腫瘤生長速度明顯高于CD133-組小鼠。
　　3）免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)，相對于ALDH-組小鼠，ALDH1+組小鼠ALDH1表達(dá)升高，同時VE-cadherin, Twist

16、1表達(dá)也升高，而E-cadherin表達(dá)降低。CD133+組小鼠對比CD133-組，CD133表達(dá)升高,同時VE-cadherin和Twist1表達(dá)升高，E-cadherin表達(dá)降低。
　　4） endomucin/PAS雙重染色結(jié)果顯示，ALDH1+組小鼠中VM陽性率明顯高于ALDH1-組。
　　研究結(jié)論：
　　1、人三陰乳腺癌中CD44的表達(dá)高于非三陰乳腺癌，CD44陽性患者預(yù)后更差， CD44的表達(dá)與乳腺癌中VM

17、、VE-cadherin表達(dá)和TNM分期呈正相關(guān)， CD24的表達(dá)同VM呈負(fù)相關(guān)。說明三陰乳腺癌其惡性程度高、患者預(yù)后差可能與乳腺癌干細(xì)胞的高含量有關(guān)，乳腺癌干細(xì)胞可能參與了腫瘤VM的形成。
　　2、三陰乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中的ALDH1+和CD133+表型的腫瘤干細(xì)胞含量要高于非三陰乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中的含量。相對于ALDH1-231細(xì)胞, ALDH1+231的遷移、侵襲和形成管道結(jié)構(gòu)的能力更強(qiáng)，EMT相關(guān)蛋白表