OPN與乳腺癌細(xì)胞體外形成血管生成擬態(tài)關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　 骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)在人類乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并可能參與了某些腫瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)(Vasculogenic mimicry，VM)的形成。在本項(xiàng)研究中，我們調(diào)查OPN是否在乳腺癌細(xì)胞的VM形成中起作用，并探討OPN和VM形成相關(guān)蛋白MMP-9和VEGF之間是否有關(guān)聯(lián)。
　　 方法：
　　 1、運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將針對(duì)OPN編碼基因的不同序列的重組質(zhì)粒miR-opn1、miR

2、-opn2、miR-opn3、miR-opn4分別轉(zhuǎn)染至人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中，WB檢測(cè)挑選沉默效率最高的質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2、實(shí)驗(yàn)分組：正常組(contro1)、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組(LipLTX)、陰性質(zhì)粒對(duì)照組(miR-neg)和轉(zhuǎn)染組(miR-opn2)，分別轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株30h后，收集細(xì)胞進(jìn)行體外三維培養(yǎng)，24h后倒置顯微鏡下觀察各組VM的數(shù)量，并通過(guò)PAS染色證實(shí)VM的存在。
　　 3、三維

3、培養(yǎng)24h后，提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，用RT-PCR、Western Blot技術(shù)測(cè)定OPN、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 1、miR-opn1、miR-opn2、miR-opn3和miR-opn4分別轉(zhuǎn)染至人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中，熒光顯微鏡觀察結(jié)果和WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-opn2質(zhì)粒的沉默效率較其他組高，可進(jìn)行后期實(shí)驗(yàn)。
　　 2、轉(zhuǎn)染組(miR-opn2)的

4、MDA-MB-231細(xì)胞株形成VM的數(shù)量比正常組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組、陰性質(zhì)粒對(duì)照組的明顯減少(P<0.05)，正常組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組、陰性質(zhì)粒對(duì)照組組間相比無(wú)顯著性差異，說(shuō)明OPN參與了MDA-MB-231細(xì)胞株的VM形成。
　　 3、轉(zhuǎn)染組(miR-opn2)的MDA-MB-231細(xì)胞株OPN、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平均比正常組、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組、陰性質(zhì)粒對(duì)照組(miR-neg)明顯下降(P<0.05)，正常組

5、、轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組、陰性質(zhì)粒對(duì)照組(miR-neg)組間相比無(wú)顯著差異，提示OPN參與VM的形成很可能是通過(guò)影響VM生成相關(guān)蛋白MMP-9和VEGF實(shí)現(xiàn)的。
　　 結(jié)論：
　　 1、體外三維培養(yǎng)模型中人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231能夠形成典型的PAS染色陽(yáng)性的VM現(xiàn)象。
　　 2、靶向沉默OPN蛋白能夠有效抑制體外三維培養(yǎng)模式中MDA-MB-231形成VM的數(shù)量，提示OPN蛋白參與了VM的形成。