乳腺癌細(xì)胞中ZEB1對VEGFA表達(dá)及血管生成的調(diào)控作用.pdf

1、乳腺癌是繼肺癌之后，全球發(fā)病率最高的癌癥。乳腺癌的死亡率位居癌癥死亡率的第五位，是威脅女性身體健康的主要殺手。無論是乳腺癌還是其他類型的癌癥，血管生成對于實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移都是至關(guān)重要的。通過血管生成，腫瘤不但獲得了營養(yǎng)，排出了代謝廢物，而且為腫瘤進一步向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移提供了機會。
　　在眾多影響血管生成的因子中，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)是一種非常重要的促進血管新

2、生的因子。VEGF是具有肝素結(jié)合活性的堿性蛋白質(zhì)。它被高度糖基化，兩個相同的亞基以二硫鍵相交聯(lián)結(jié)合在一起。VEGF不僅在胚胎發(fā)育、維持血管穩(wěn)定性以及促進骨骼肌肉分化等正常生理進程中發(fā)揮作用，而且也參與到多種病理性的血管形成過程中。癌癥研究證實，VEGF與腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。
　　在脊椎動物中，轉(zhuǎn)錄因子ZEB1是ZEB家族成員之一。它是一類E-box結(jié)合鋅指蛋白。ZEB家族成員具有共同的結(jié)構(gòu)特點:蛋白的N端和C端

3、各有一個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，中間為同源結(jié)構(gòu)域。ZEB1通過其N端和C端的鋅指結(jié)構(gòu)簇與被調(diào)控基因啟動子區(qū)的E-box結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能。ZEB1在乳腺癌的多個調(diào)控關(guān)鍵環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，但有關(guān)ZEB1對于乳腺癌血管生成的調(diào)控機理尚未見詳細(xì)報道。
　　在本研究中，我們檢測了ZEB1對于乳腺癌血管生成的潛在功能，應(yīng)用體內(nèi)體外模型探究了其作用機理。為了研究ZEB1在乳腺癌血管生成中的潛在作用，我們成功構(gòu)建了ZEB1穩(wěn)定表達(dá)的MDA-MB-

4、231細(xì)胞株。用空載體對照MDA-MB-231細(xì)胞和ZEB1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞的濃縮條件培養(yǎng)基分別處理事先接種于Matrigel上的人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，觀察兩種條件培養(yǎng)基對HUVEC細(xì)胞血管形成能力的影響。血管形成實驗檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，穩(wěn)定表達(dá)ZEB1的MDA-MB-231細(xì)胞株的濃縮條件培養(yǎng)基具有更加顯著地促進HUVEC細(xì)胞血管形成的作用。因此，我們認(rèn)為ZEB1可能是通過促進血管生成相關(guān)因子的表達(dá)和分泌發(fā)

5、揮作用的。為了進一步驗證上述觀點，我們利用RT2profiler PCR array（Human Angiogenesis）檢測了ZEB1對于一系列與血管生成功能相關(guān)基因表達(dá)的影響。RT2profiler PCR array的實驗結(jié)果顯示，在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，ZEB1可以特異性地促進VEGFA基因的表達(dá)。
　　隨后，我們在MDA-MB-231細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染了人ZEB1的表達(dá)質(zhì)粒，利用Quantitative PCR

6、、Western Blot和ELISA檢測了ZEB1對VEGFA表達(dá)和分泌的影響。實驗結(jié)果顯示，ZEB1能夠特異性地上調(diào)VEGFA mRNA和蛋白的表達(dá)，促進細(xì)胞分泌更多的VEGFA蛋白。
　　VEGFA可以通過多條信號通路發(fā)揮作用。因此，我們檢測了參與調(diào)控ZEB1促進VEGFA表達(dá)的信號通路途徑。在MDA-MB-231細(xì)胞中，瞬時轉(zhuǎn)染人ZEB1表達(dá)質(zhì)粒，加入不同信號通路的特異性抑制劑（PI3K、NF-κB和MAPKs等信號通路特

7、異性的信號通路抑制劑）。應(yīng)用Q-PCR、Western Blot和ELISA檢測了不同信號通路特異性的抑制劑對VEGFA表達(dá)和分泌的影響。實驗結(jié)果顯示，ZEB1通過p38和PI3K信號通路途徑特異性地促進VEGFA的表達(dá)和分泌。
　　更進一步，我們分別構(gòu)建了2.1K、1.6K、1.0K和0.5K四個不同截短長度的VEGFA啟動子-熒光素酶報告基因質(zhì)粒，用于研究ZEB1促進VEGFA轉(zhuǎn)錄的分子機制。將ZEB1和上述不同截短長度的VE

8、GFA啟動子-熒光素酶報告基因質(zhì)粒共同瞬時轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，檢測ZEB1對各質(zhì)粒熒光素酶活性的影響。Luciferase實驗結(jié)果顯示，ZEB1可以顯著地上調(diào)VEGFA各啟動子活性，而ZEB1對各啟動子活性的影響無統(tǒng)計學(xué)差異。我們認(rèn)為ZEB1對VEGFA轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)控范圍在VEGFA的-550/+34之間。結(jié)合文獻報道，Sp1結(jié)合位點在維持VEGFA啟動子活性方面具有重要作用。通過轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測軟件預(yù)測，VEGFA啟動子

9、-150/+1之間的Sp1結(jié)合位點是ZEB1作用的潛在位點。應(yīng)用定點突變技術(shù)，我們構(gòu)建了Sp1結(jié)合位點突變的0.5K VEGFA啟動子-熒光素酶報告基因質(zhì)粒。Luciferase檢測ZEB1對0.5K野生型和突變型VEGFA啟動子活性的影響。實驗結(jié)果顯示，Sp1結(jié)合位點對于維持VEGFA啟動子活性至關(guān)重要，它的突變削弱了ZEB1對VEGFA啟動子活性的促進作用，ZEB1通過VEGFA啟動子上的Sp1結(jié)合位點激活其轉(zhuǎn)錄。與此同時，Q-CH

10、IP實驗進一步證實，ZEB1能夠促進Sp1募集到VEGFA的啟動子，增強VEGFA基因的轉(zhuǎn)錄活性。
　　為了進一步驗證以上實驗結(jié)論，我們又在128例人乳腺癌組織臨床標(biāo)本中，利用免疫組織化學(xué)IHC檢測了ZEB1、VEGFA和CD31的表達(dá)情況。IHC結(jié)果顯示，ZEB1主要表達(dá)在腫瘤的間質(zhì)細(xì)胞核，在癌細(xì)胞的胞漿和少數(shù)病例的胞核中也有表達(dá)。根據(jù)ZEB1表達(dá)部位的不同，統(tǒng)計分析了ZEB1與VEGFA、ZEB1與CD31的表達(dá)相關(guān)性。統(tǒng)計結(jié)