miR-100在對蝦及乳腺癌細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用.pdf

1、細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而主動有序的死亡，細(xì)胞凋亡不僅是免疫反應(yīng)的重要部分，也與許多疾病尤其是癌癥的發(fā)生有著密切的關(guān)系。對蝦是一類低等的無脊椎動物，其免疫系統(tǒng)反應(yīng)只有先天性免疫系統(tǒng)，細(xì)胞凋亡屬于對蝦先天性免疫系統(tǒng)的血細(xì)胞防御系統(tǒng)，其在對蝦對抗外界不良環(huán)境過程中起著十分重要的作用，已有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在對蝦抗病毒過程中起到了十分重要的作用。研究對蝦細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)理，能夠為動物抗病毒免疫及癌癥的發(fā)生發(fā)展提供新的思路和方法。很多研究

2、報道發(fā)現(xiàn)，非編碼小RNA---miRNA能夠通過調(diào)節(jié)參與細(xì)胞凋亡的基因的轉(zhuǎn)錄后水平，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，但是目前對參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的miRNA的研究不多，因而進(jìn)行這一方面的研究具有十分重要的意義。
　　 本實驗室的前期研究中，通過對對蝦體內(nèi)miRNAs進(jìn)行測序，獲得了參與調(diào)控對蝦細(xì)胞凋亡的miRNA。本試驗中，通過將三種不同處理的對蝦血淋巴細(xì)胞（正常血淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的血淋巴細(xì)胞，抑制細(xì)胞凋亡的血淋巴細(xì)胞）進(jìn)行對蝦miRNA

3、芯片雜交試驗，篩選獲得10條與對蝦細(xì)胞凋亡相關(guān)的miRNA。通過northernblot，結(jié)果顯示有6條miRNA的northernblot結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)相符。挑取其中一條進(jìn)化保守的miR-100，進(jìn)一步的研究其在對蝦細(xì)胞凋亡過程中的作用。通過將特異修飾的miR-100反義核酸注射到對蝦體內(nèi)敲低miR-100的表達(dá)，檢測對蝦血淋巴細(xì)胞caspase3/7酶活，試驗結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)的caspase3/7酶活活力明顯上升，說明miR-100能

4、夠抑制對蝦細(xì)胞細(xì)胞凋亡的發(fā)生。為了進(jìn)一步研究miR-100在對蝦抗病毒過程中的作用，在通過注射miR-100的反義核酸降低對蝦體內(nèi)的miR-100含量的情況下，檢測對蝦感染病毒的拷貝數(shù)和對蝦死亡率的變化，結(jié)果顯示表明注射miR-100反義核酸引起的細(xì)胞凋亡能夠降低病毒的拷貝數(shù)和對蝦的死亡率，從而起抗病毒作用。
　　 目前，越來越多的研究報道顯示，細(xì)胞miRNA的異常表達(dá)與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-100

5、是從無脊椎動物到脊椎動物進(jìn)化保守的一種miRNA，在乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3中miR-100相比于其他乳腺細(xì)胞（MCF-7和MDA-MB-453）其含量明顯的上調(diào)。因而，推測miR-100在乳腺癌細(xì)胞中也具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。為了研究miR-100在乳腺癌細(xì)胞凋亡過程中的作用，我們通過轉(zhuǎn)染miR-100的反義核酸或者miR-100前體分別敲低或者過量表達(dá)miR-100。在此基礎(chǔ)上，通過檢測細(xì)胞caspase3/7酶活、細(xì)胞線粒體活力

6、、凋亡關(guān)鍵蛋白的含量、AnnexinⅤ流式檢測細(xì)胞凋亡等方法，判斷乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡是否受到影響。試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-100反義核酸的乳腺癌細(xì)胞會發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡，而轉(zhuǎn)染miR-100前體的乳腺癌細(xì)胞則沒有細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這說明miR-100能抑制乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　 為了進(jìn)一步的探索miR-100調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理，我們通過表達(dá)譜芯片和生物信息學(xué)的方法篩選miR-100可能的靶

7、基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FGFR3和MTMR3基因可能是miR-100的靶基因;根據(jù)雙熒光報告質(zhì)粒靶基因驗證系統(tǒng)的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MTMR3是miR-100直接作用的靶基因。MTMR3在miR-100含量被敲低的乳腺癌細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)，能促進(jìn)p27蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。但是，通過RNAi方法抑制MTMR3在乳腺癌細(xì)胞里的mRNA水平后，再轉(zhuǎn)染miR-100反義核酸仍然能夠引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，說明miR-100能調(diào)控多個參與細(xì)胞凋亡的