二甲雙胍對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移的影響及miR-625的調(diào)控作用.pdf

1、目的：
　　1.探討二甲雙胍對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7侵襲遷移的影響。
　　2.研究二甲雙胍刺激乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7后對(duì)miR-625表達(dá)的影響。
　　3.通過轉(zhuǎn)染miR-625的模擬物及抑制物來探討其對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7的侵襲遷移的影響。
　　4.檢測(cè)miR-625轉(zhuǎn)染兩株細(xì)胞后侵襲遷移相關(guān)蛋白及靶基因蛋白的變化，探討靶基因的調(diào)控機(jī)制。
　　

2、方法：
　　1.研究以侵襲遷移能力較強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231及侵襲遷移能力較弱的乳腺癌細(xì)胞MCF-7為研究對(duì)象，使用不同濃度的二甲雙胍作用于乳腺癌細(xì)胞，48 h、72 h后采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制作用，并據(jù)此結(jié)果選擇對(duì)細(xì)胞增殖影響較小的濃度進(jìn)行以下的侵襲遷移實(shí)驗(yàn)。
　　2.通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)二甲雙胍對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7侵襲遷移的影響，同時(shí)使用qRT-PCR檢測(cè)二甲雙胍作

3、用于兩株細(xì)胞后miR-625的表達(dá)。3.利用qRT-PCR方法檢測(cè)兩株細(xì)胞中miR-625的表達(dá)量。
　　4.以 miR-625為檢索詞，通過靶基因預(yù)測(cè)軟件 TargetScan、PicTar、miRanda和miRbase預(yù)測(cè)出靶基因，并通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶基因蛋白的變化。
　　5.根據(jù)兩株細(xì)胞miR-625表達(dá)量的差異，將miR-625的模擬物轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，miR-625的抑制物

4、轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MCF-7，利用Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞侵襲遷移的影響。
　　6.將miR-625轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白TIMP1和上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)蛋白的變化及初步驗(yàn)證 miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1.二甲雙胍對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7增殖

5、及侵襲遷移作用的影響
　　MTT結(jié)果顯示，二甲雙胍能明顯的抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖能力，而且抑制活性隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加而增強(qiáng)，較小濃度的二甲雙胍(2 mmol·L-1)在一定的程度上可以抑制兩株乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力(P<0.05)。
　　2.二甲雙胍影響乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中miR-625的表達(dá)
　　用二甲雙胍刺激乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231和 M

6、CF-748 h后，提取細(xì)胞microRNA，通過qRT-PCR檢測(cè)miR-625的表達(dá)量，結(jié)果顯示，二甲雙胍作用于細(xì)胞后miR-625的表達(dá)量顯著增高。
　　3.乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7中 miR-625的表達(dá)量
　　qRT-PCR檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7中miR-625的表達(dá)量，根據(jù)2-△△Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示：MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中miR-625的表

7、達(dá)量有顯著的差異，MCF-7細(xì)胞中miR-625的表達(dá)量顯著高于MDA-MB-231細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4. miR-625靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
　　miR-625相關(guān)靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，通過常用的靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)出與miR-625相互作用的靶基因，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)SCAI正是我們的目標(biāo)靶基因，因此我們就選擇SCAI進(jìn)行預(yù)測(cè)的鑒定。
　　5. miR-625轉(zhuǎn)染后對(duì)乳腺癌細(xì)胞MD

8、A-MB-231、MCF-7侵襲轉(zhuǎn)移的影響
　　根據(jù)qRT-PCR顯示，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中miR-625的表達(dá)量相對(duì)較低，而乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的表達(dá)量相對(duì)較高，所以我們將miR-625模擬物轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-625抑制物轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-625組與NC組相比細(xì)胞穿膜數(shù)目并沒有顯著變化，而MCF-7細(xì)胞中，anti-mi

9、R-625組相對(duì)anti-NC組細(xì)胞穿膜數(shù)目顯著增多，劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：轉(zhuǎn)染miR-625模擬物的MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力較陰性對(duì)照組相比變化不明顯，轉(zhuǎn)染miR-625抑制物的MCF-7細(xì)胞遷移能力較陰性對(duì)照組明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　6. Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-625轉(zhuǎn)染后靶基因蛋白及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的變化
　　通過上述Transwell實(shí)驗(yàn)可知，miR-625在乳腺癌細(xì)胞

10、MCF-7中可能起到了抑制其侵襲遷移的作用，Western blot檢測(cè)可知轉(zhuǎn)染 miR-625抑制物的乳腺癌細(xì)胞MCF-7，48 h后靶基因SCAI蛋白明顯降低，TIMP1蛋白明顯降低， EMT相關(guān)蛋白E-cadherin降低，提示有可能也誘導(dǎo)出現(xiàn)了EMT。
　　結(jié)論：
　　1.二甲雙胍能夠抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7的侵襲遷移能力，而且可以使miR-625的表達(dá)升高。
　　2. miR-625在高