二甲雙胍抑制人前列腺癌細胞上皮間質轉化及作用機制的研究.pdf

1、前列腺癌(ProstateCancer,PCa)是男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，近年來，前列腺癌在我國的發(fā)病率快速增長，正日益成為嚴重威脅老年男性健康的疾病。目前臨床治療面臨的課題之一是如何針對“侵襲性”(aggressive)前列腺癌選擇高效低毒的藥物，降低復發(fā)和轉移的風險。二甲雙胍(1，1-Dimethylbiguanide)是治療Ⅱ型糖尿病最常用的藥物之一。近年來，越來越多的證據(jù)提示，二甲雙胍可以延緩部分前列腺癌患者腫瘤的生長

2、速度并降低前列腺癌的罹患風險。但二甲雙胍的抗腫瘤機制尚未完全明確。
　　腫瘤的侵襲和轉移是前列腺癌病人死亡的重要原因。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）與惡性腫瘤的侵襲和轉移密切相關。最近的研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞中，二甲雙胍可抑制TGF-β信號通路促進的EMT過程，表現(xiàn)為TGFβ介導的E-cadherin下調與Vimentin上調的效應消失。這一成果為后續(xù)研究

3、提供了一定的思路和參考。由于前列腺癌和乳腺癌均為激素相關性腫瘤，我們推測二甲雙胍對前列腺癌細胞EMT的發(fā)生過程亦可能發(fā)揮重要作用，但是目前尚未有相關研究報道。
　　本研究使用不同濃度的二甲雙胍處理前列腺癌Vcap細胞，通過MTS比色法、流式細胞術分析、劃痕和侵襲小室實驗檢測二甲雙胍對Vcap細胞生物學行為的影響;采用RT-PCR和Westernblot測定二甲雙胍對Vcap細胞上皮指標物（E-cadherin、β-catenin）

4、和間質指標物(Vimentin、N-cadherin)mRNA和蛋白表達水平的影響，闡明二甲雙胍調控前列腺腫瘤細胞發(fā)生EMT過程的分子機制;使用RT-PCR檢測二甲雙胍處理Vcap細胞后miRNA的表達水平變化，初步闡明二甲雙胍對前列腺腫瘤細胞miRNA的調控作用。
　　方法:
　　1.采用MTS法分別測定不同濃度二甲雙胍(1、5、10、50mmol/L)處理前列腺癌Vcap細胞24、48和72h后對細胞增殖的影響。

5、　　2.流式細胞儀檢測5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細胞24h后細胞周期的分布變化。
　　3.劃痕實驗和細胞侵襲小室實驗檢測二甲雙胍對前列腺癌Vcap細胞遷移和侵襲能力的作用。
　　4.RT-PCR和Western-blot分別檢測5mmol/L二甲雙胍處理24h、48h后對Vcap細胞上皮指標物(E-cadherin、β-catenin)和間質指標物（Vimentin、N-cadherin）mRNA和蛋白表達水平的影響

6、，闡明二甲雙胍調控前列腺腫瘤細胞發(fā)生EMT過程的分子機制。
　　5.運用RT-PCR檢測5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細胞24h后對miRNA的表達水平的影響。闡明二甲雙胍對Vcap細胞miRNA的調節(jié)作用。
　　6.miR30a類似物和miR30a抑制物分別作用Vcap細胞24h、48h、72h后，采用MTS法檢測對Vcap細胞增殖的影響。運用RT-PCR檢測miR30a類似物處理Vcap細胞24h后對上皮指標物（E-

7、cadherin）和間質指標物(Vimentin)mRNA的影響。闡明miR30a在二甲雙胍調控Vcap細胞EMT中發(fā)揮的作用。
　　結果:
　　1.MTS實驗結果:二甲雙胍抑制前列腺癌Vcap細胞的增殖，呈濃度和時間依賴性。
　　2.二甲雙胍對Vcap細胞細胞周期分布的影響:5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細胞48h后，與對照組相比，G0/G1期細胞比例明顯增加(54.1％vs.77.2％)，而S期(13.8％vs

8、.6.7％)和G2/M期(32.1％vs.16.1％)細胞比例均顯著減少。
　　3.二甲雙胍抑制Vcap細胞的遷移和侵襲能力:5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細胞48h后，劃痕愈合率顯著低于對照組，提示二甲雙胍處理后，腫瘤細胞的遷移能力顯著降低。侵襲小室實驗顯示5mmol/L二甲雙胍可明顯抑制Vcap細胞的侵襲能力。與對照組細胞相比，5mmol/L二甲雙胍抑制細胞侵襲的能力達到45％以上(P＜0.01，n=3)。
　　4.

9、二甲雙胍抑制Vcap細胞EMT的發(fā)生:5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細胞24h后，EMT相關的上皮標志物及間質標志物均發(fā)生較顯著的變化。與對照組比較，二甲雙胍處理組中，Vcap細胞的上皮性標志物E-cadherin和β-catenin的mRNA表達水平明顯升高，分別高于對照組6.2倍(P=0.023)、1.2倍(P=0.034);間質性標志物Vimentin和N-cadherin的mRNA水平明顯降低，分別較對照組低3.6倍(P=0

10、.002)和2.9倍(P=0.013)。5mmol/L二甲雙胍處理Vcap細胞48h后，Westernblot顯示E-cadherin和β-catenin的蛋白表達水平明顯升高，而Vimentin和N-cadherin的蛋白表達水平顯著降低。
　　5.二甲雙胍對Vcap細胞miRNA的調節(jié)作用:與對照組相比，5mmol/L二甲雙胍處理24h后，可明顯上調Vcap細胞中miR30a，miR143和miR196b的表達水平，其中，mi

11、R30a的變化效應最顯著（呈3.5倍改變），但Vcap細胞的miR185和miR205的表達水平未有明顯變化。
　　6.miR30a對Vcap細胞增殖和EMT的影響:miR30a的類似物和抑制物分別作用Vcap細胞株24、48、72h后，與對照組相比，miR30a的類似物可明顯抑制Vcap細胞的增殖，而miR30a的抑制物可明顯促進Vcap細胞的增殖(P＜0.05)。進一步的試驗發(fā)現(xiàn)，miR30a的類似物作用Vcap細胞24小時后

12、，上皮性標志物E-cadherinmRNA水平明顯增高，而間質性標志物Vimentin的mRNA水平明顯降低。
　　結論:
　　1.二甲雙胍明顯抑制前列腺癌Vcap細胞的增殖，且呈濃度和時間依賴性。
　　2.二甲雙胍阻滯前列腺癌Vcap細胞進入S期，使其停留在G0/G1期。
　　3.二甲雙胍抑制前列腺癌Vcap細胞的遷移和侵襲能力。
　　4.二甲雙胍抑制前列腺癌Vcap上皮間質轉化的過程，該過程可能與二甲雙