低濃度二甲雙胍誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是一種惡性程度高，進(jìn)展快，易轉(zhuǎn)移，預(yù)后差的腫瘤。在世界范圍內(nèi)惡性腫瘤中，發(fā)病率排第五位，死亡率位居第二位，且近年來(lái)發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢(shì)。由于起病隱匿，早期診斷率低，對(duì)放化療不敏感，患者肝功能受損，耐受性差，導(dǎo)致肝癌總體治療效果并不理想。目前雖然對(duì)肝癌的防治研究取得了一定進(jìn)展，但仍遠(yuǎn)未闡明。
　　二甲雙胍是一種臨床上廣泛應(yīng)用的降糖藥物，近年

2、來(lái)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤作用，引起科學(xué)界廣泛關(guān)注，但其機(jī)制尚未闡明。本課題組前期體外研究發(fā)現(xiàn)，高濃度二甲雙胍主要誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，這與以往的研究結(jié)果相一致。令我們感興趣的是，低濃度二甲雙胍則通過(guò)激活 AMPK/SIRT1通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖。為了更好地體現(xiàn)藥物在體內(nèi)的分布及代謝對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，本研究擬通過(guò)建立裸鼠皮下移植肝癌和原位移植肝癌模型，腹腔注射不同濃度二甲雙胍，探討藥物對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)和衰老的影響及

3、其分子機(jī)制。本研究有望為二甲雙胍抗肝癌提供新的理論依據(jù)，并為以后利用AMPK/SIRT1信號(hào)通路作為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老的新靶點(diǎn)提供重要的線(xiàn)索。
　　方法：
　　（1）分別建立肝癌 HepG2細(xì)胞皮下移植瘤裸鼠模型和原位移植瘤裸鼠模型，依處理方法不同分為：對(duì)照組（腹腔注射0.9％生理鹽水/kg/d）、低濃度二甲雙胍組(腹腔注射Met50mg/kg/d）和高濃度二甲雙胍組(腹腔注射Met250mg/kg/d）。腫瘤種植后第10d開(kāi)

4、始給藥，藥物治療周期為30天。
　?。?）皮下移植瘤裸鼠模型：在腹腔注射藥物的當(dāng)天，隨后的第5d、10d、15d、20d、25d和實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天（第30d）測(cè)量裸鼠體重以及腫瘤的長(zhǎng)短徑，計(jì)算腫瘤體積(V)和抑瘤率(IR)。第30天測(cè)量皮下移植瘤裸鼠腫瘤重量。在給藥當(dāng)天以及給藥后第10d、20d和30d，分別用血糖儀和肝功能自動(dòng)分析儀測(cè)定裸鼠血糖和肝功能。原位移植瘤裸鼠模型：在腹腔注射藥物的當(dāng)天，隨后的第5d、10d、15d、20d、

5、25d和實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天（第30d）測(cè)量裸鼠的體重，在給藥當(dāng)天以及給藥后第10d、20d和30d，使用血糖儀對(duì)裸鼠血糖進(jìn)行測(cè)定。
　?。?） HE染色觀察二甲雙胍對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤、肝臟、心臟、肺、腦、胃、脾、腎和小腸形態(tài)學(xué)的影響；HE染色觀察二甲雙胍對(duì)原位移植瘤裸鼠腫瘤和肝臟形態(tài)學(xué)的影響。
　?。?）免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)兩種裸鼠腫瘤組織標(biāo)本中 Ki-67和 Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)；采用細(xì)胞衰老特異性β-

6、半乳糖苷酶原位染色試劑盒檢測(cè)二甲雙胍對(duì)兩種裸鼠腫瘤組織衰老的影響。
　　（5）采用免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種裸鼠腫瘤組織中AMPK/SIRT1信號(hào)通路相關(guān)分子p-AMPK、SIRT1、p-SIRT1、Ac-p53和p21蛋白的表達(dá)情況；Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種裸鼠腫瘤組織中AMPK/SIRT1信號(hào)通路相關(guān)分子AMPK、p-AMPK、SIRT1、p-SIRT1、p53、Ac-p53和p21的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：

7、　　（1）兩種移植瘤裸鼠模型，每種模型60只，皮下移植瘤裸鼠模型成瘤率為100%，原位移植瘤裸鼠死亡6只，成瘤率為90%。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，裸鼠對(duì)藥物的耐受良好，沒(méi)有出現(xiàn)厭食等異常情況。分別測(cè)量?jī)煞N裸鼠體重，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組間體重相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。皮下移植瘤裸鼠模型：腫瘤重量測(cè)量結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，Met50組腫瘤重量減輕（P<0.05），Met250組腫瘤重量明顯下降（P<0.01）。對(duì)三組裸鼠皮下移植瘤大小進(jìn)行

8、測(cè)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物治療的第20d、25d和30d，與對(duì)照組相比，Met250組裸鼠腫瘤體積變小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過(guò)計(jì)算腫瘤抑瘤率( IR)發(fā)現(xiàn)，Met50組、Met250組腫瘤抑制率分別為25.6%和48.3%。上述結(jié)果表明二甲雙胍能夠顯著抑制皮下移植瘤裸鼠腫瘤組織的生長(zhǎng)，其中高濃度組效果更明顯。
　?。?）使用血糖儀和肝功能自動(dòng)分析儀分別測(cè)定皮下移植瘤裸鼠血糖和肝功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組間血糖及肝功能相比，差異無(wú)

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示藥物不影響皮下移植瘤裸鼠血糖和肝功能，這與原位移植瘤裸鼠血糖檢測(cè)結(jié)果相一致。
　　（3）對(duì)皮下移植瘤裸鼠腫瘤、肝臟、心臟、肺、腦、胃、脾、腎和小腸采用HE染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤組織內(nèi)粉紅色壞死灶明顯升高，其它臟器三組間均未見(jiàn)異常變化；對(duì)原位移植瘤裸鼠腫瘤和肝臟采用HE染色，和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤組織內(nèi)粉紅色壞死灶明顯升高，肝臟組織三組間相比，均未見(jiàn)明顯差異。
　?。?

10、）采用免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)二甲雙胍對(duì)兩種裸鼠移植瘤組織增殖和凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低（P<0.01），而Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），Met250組尤其明顯。初步提示：高濃度二甲雙胍主要通過(guò)促進(jìn)裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡從而顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這與已報(bào)道的研究結(jié)果相一致。分別對(duì)兩種移植瘤裸鼠三組腫瘤組織采用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組相比，

11、Met50組裸鼠腫瘤組織衰老染色顯著增加（ P<0.01）， Met250組腫瘤組織衰老染色也明顯增多（P<0.05），對(duì)Met50組和Met250組裸鼠腫瘤組織衰老染色比較發(fā)現(xiàn)，Met50組陽(yáng)性染色明顯增多（P<0.05）。結(jié)果提示，低濃度二甲雙胍主要通過(guò)誘導(dǎo)裸鼠腫瘤細(xì)胞衰老而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。
　　（5）通過(guò)免疫組化和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種移植瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組相比，Met50組裸

12、鼠腫瘤組織內(nèi)p-AMPK、p-SIRT1、Ac-p53和p21蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，而AMPK、SIRT1、p53蛋白的表達(dá)卻未見(jiàn)明顯差別。這些結(jié)果表明，低濃度二甲雙胍通過(guò)激活 AMPK，上調(diào)SIRT1的磷酸化水平，抑制其去乙?；富钚?，促進(jìn)p53乙酰化，使p53下游靶基因p21表達(dá)上調(diào)，從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞衰老。
　　結(jié)論：
　　（1）低濃度二甲雙胍主要誘導(dǎo)肝癌裸鼠腫瘤細(xì)胞衰老，高濃度二甲雙胍則主要誘導(dǎo)肝癌裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡。<