二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞增殖和凋亡的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥死亡病因第二位，嚴重危害人們的健康。其惡性程度高，治療效果差，病死率較高。肝癌患者5年預(yù)后生存率小于15％，缺乏有效的治療藥物，因此，探索其發(fā)生發(fā)展過程中的特異性機制，有針對性的預(yù)防和診斷治療，對肝癌防治有著重要的意義。
　　腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展過程中需要大量葡萄糖，即使在無氧條件下，惡性腫瘤細胞更傾向于無氧糖酵解的途徑來獲取能量，這便是著名的瓦博格效應(yīng)。因此，葡萄糖是大多數(shù)惡性腫瘤的能量來

2、源。目前低糖治療已經(jīng)作為一種新的腫瘤治療方式被運用到臨床。靶向能量代謝是抗癌治療的一個新的方向。
　　二甲雙胍是常用的一種降糖藥。近年研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有一定的抗腫瘤作用，減少糖尿病患者罹患惡性腫瘤的風(fēng)險，增強藥物的療效。有研究報道，二甲雙胍一方面能夠減少肝臟糖異生和血液中葡萄糖的釋放，限制了肝臟的緩沖功能，并在營養(yǎng)素攝入減少期間加大了血清葡萄糖的降低水平;另一方面，二甲雙胍已被證明是通過直接抑制可能由短期葡萄糖缺乏引起的能量補

3、充消耗的線粒體呼吸復(fù)合物Ⅰ，阻礙癌癥細胞的生長。2-脫氧-D-葡萄糖，是一種葡萄糖類似物，能夠阻斷葡萄糖代謝，損耗腫瘤細胞的能力供給。有研究報道，2-脫氧-D-葡萄糖能增加氧化應(yīng)激，抑制糖基化，并誘導(dǎo)細胞自噬。也可以有效地延緩細胞生長，有效促進特定的腫瘤細胞的凋亡。雖然2-脫氧-D-葡萄糖本身在許多類型的癌癥的治療作用有限，它可以結(jié)合其他治療藥物或放射治療具有協(xié)同抗腫瘤作用。
　　細胞自噬是依賴溶酶體途徑對胞質(zhì)和細胞器進行降解的一

4、種過程，在進化上具有高度保守性，其在細胞死亡，細胞存活，衰老和代謝的生理和病理過程起著重要的作用。更重要的是，自噬是一個關(guān)鍵的促進細胞存活的應(yīng)激機制。PI3K/AKT/mTOR信號通路具有調(diào)節(jié)自噬的作用。AKT磷酸化是該通路上的一個的重要環(huán)節(jié)，對腫瘤細胞存活和凋亡有著重要的作用。本論文通過研究二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖缺乏對肝癌細胞的增殖情況，繼而用2-脫氧-D-葡萄糖代替葡萄糖缺乏，聯(lián)合二甲雙胍對肝癌細胞增殖和凋亡的作用，并進一步探討促凋亡的

5、機制，以期為預(yù)防和治療肝癌患者提供新的靶點方向。
　　第一章二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖缺乏對肝癌細胞增殖和凋亡的影響
　　目的:探索二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖缺乏對肝癌細胞增殖和凋亡的影響
　　方法:
　　1.用全培養(yǎng)液、無血清培養(yǎng)液以及無葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌HepG2、Hep3B、HCCM、Huh7和PLC/5細胞，利用Wst-1試劑觀察肝癌細胞不同時間段的增殖情況。
　　2.利用流式細胞術(shù)檢測全培養(yǎng)液、谷氨酰胺和葡萄糖

6、雙缺乏培養(yǎng)液、葡萄糖補充培養(yǎng)液、谷氨酰胺補充培養(yǎng)液以及兩者均補充培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌細胞48h后的subG1凋亡率。
　　3.把二甲雙胍加入到培養(yǎng)液中。實驗分成四組，全培養(yǎng)液組，二甲雙胍全培養(yǎng)液組、無葡萄糖培養(yǎng)液組和二甲雙胍無葡萄糖培養(yǎng)液組，培養(yǎng)肝癌Huh7和HepG2細胞，分別在24h和48h后觀察細胞的形態(tài)學(xué)改變，然后利用流式細胞術(shù)的方法，檢測肝癌細胞的存活情況。
　　4.運用蛋白免疫印跡技術(shù)分析全培養(yǎng)液組、二甲雙胍全培養(yǎng)液組

7、、無葡萄糖培養(yǎng)液組和二甲雙胍無葡萄糖培養(yǎng)液組培養(yǎng)的肝癌Huh7細胞的PARP、Caspase-3、Mcl-1、LC3及p-AKT等相關(guān)蛋白的變化。
　　結(jié)果:
　　1.無葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌細胞相比較全培養(yǎng)液和無血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)的肝癌細胞，增殖率隨著時間逐漸下降，其中肝癌HepG2、HCCM細胞變化最明顯。
　　2.葡萄糖和谷氨酰胺雙缺乏培養(yǎng)液和谷氨酰胺補充培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞subG1凋亡率分別為（94.

8、00±0.50）％和(74.80±1.92)％，與全培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞subG1凋亡率(4.40±0.21)％、葡萄糖補充培養(yǎng)液（11.00±0.21）％和兩者均補充培養(yǎng)液（7.20±0.29）％相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;而五組培養(yǎng)液培養(yǎng)的肝癌Hep3B、Huh7和PLC/5細胞的subG1凋亡率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.顯微鏡下二甲雙胍無葡萄糖培養(yǎng)液組培養(yǎng)的肝癌Huh7細胞48h后數(shù)量明顯減少，密度降低。

9、>　　4.二甲雙胍無葡萄糖培養(yǎng)液組的死亡率為（74.97±0.21）％，與無葡萄糖培養(yǎng)液組（32.69±0.89）％、二甲雙胍全培養(yǎng)液組（11.98±0.29）％及全培養(yǎng)液組（7.74±0.23）％比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;無葡萄糖培養(yǎng)液組的死亡率為（32.69±0.89）％，與二甲雙胍全培養(yǎng)液組（11.98±0.29）％及全培養(yǎng)液組（7.74±0.23）％比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.蛋白免疫印跡技術(shù)顯示，二甲雙胍無葡萄糖

10、培養(yǎng)液組可以觀察到明顯的Caspase-3激活、PARP切割，Mcl-1表達的降低，以及AKT的磷酸化，自噬相關(guān)蛋白LC3B的減少。
　　結(jié)論:
　　1.葡萄糖缺乏能夠抑制肝癌HepG2、HCCM細胞的增殖，促進細胞的凋亡。
　　2.肝癌HepG2、HCCM細胞的存活對葡萄糖缺乏比較敏感，而肝癌Hep3B、Huh7和PLC/5細胞比較耐受。
　　3.二甲雙胍能促進在葡萄糖缺乏條件下肝癌Huh7細胞的凋亡。

11、　　4.二甲雙胍能促進在葡萄糖缺乏條件下肝癌Huh7細胞的凋亡可能與AKT磷酸化和自噬有關(guān)。
　　第二章二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖對肝癌細胞的增殖和凋亡的影響
　　目的:探討二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖拮抗劑2-脫氧-D-葡萄糖對肝癌細胞的增殖和凋亡的影響及其凋亡相關(guān)蛋白的改變。
　　方法:
　　1.不同濃度二甲雙胍全培養(yǎng)液和2-脫氧-D-葡萄糖全培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌細胞，48h后利用Wst-1試劑觀察肝癌細胞的增殖情況。

12、
　　2.二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖單獨及聯(lián)合培養(yǎng)肝癌Hep3B、HepG2細胞，48h后利用Wst-1試劑觀察肝癌細胞的增殖情況。
　　3.顯微鏡下觀察二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖單獨及聯(lián)合作用肝癌HepG2、Hep3B細胞的形態(tài)學(xué)改變。
　　4.利用流式細胞術(shù)檢測全培養(yǎng)液組、二甲雙胍全培養(yǎng)液組、2-脫氧-D-葡萄糖培養(yǎng)液組、二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖組培養(yǎng)肝癌HepG2和Hep3B細胞48h后的subG

13、1死亡率。
　　5.運用蛋白免疫印跡技術(shù)分析二甲雙胍單獨及聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖培養(yǎng)肝癌HepG2細胞PARP、Caspase-3及Mcl-1相關(guān)凋亡蛋白的改變。
　　結(jié)果:
　　1.隨著二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖的濃度上升，肝癌細胞HepG2、HCCM、Hep3B及PLC/5的增殖率下降，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。
　　2.二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖組培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞的存活率為（22.48±0.51

14、）％，與二甲雙胍培養(yǎng)液組（80.68±5.10）％、2-脫氧-D-葡萄糖組（72.56±4.34）％以及對照組（100.00±5.05）％比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖組培養(yǎng)的肝癌Hep3B細胞的增殖率(29.16±1.34)％，與二甲雙胍培養(yǎng)液組（59.58±1.92）％和對照組（100.00±1.23）％比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，與2-脫氧-D-葡萄糖培養(yǎng)液組（33.87±1.95）％比較，差異不具有統(tǒng)計

15、學(xué)意義。
　　3.二甲雙胍和2-脫氧-D-葡萄糖聯(lián)合處理使得HepG2細胞數(shù)量明顯減少，細胞皺縮、脫落;而聯(lián)合組雖然也造成Hep3B、Huh7細胞密度降低，但并未顯著增加脫落的死細胞。
　　4.二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖組培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞的subG1凋亡率（39.63±0.21）％，明顯高于對照組（7.12±0.14）％、二甲雙胍組（12.56±0.35）％和2-脫氧-D-葡萄糖組（15.16±1.93）％，差

16、異有統(tǒng)計學(xué)意義; Hep3B細胞聯(lián)合組的凋亡率為(12.58±1.03)％，與對照組（2.82±0.51）％和二甲雙胍組（8.98±0.86）％比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，與2-脫氧-D-葡萄糖組（12.40±1.78）％比較，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.蛋白免疫印跡技術(shù)顯示，聯(lián)合組可以觀察到明顯的Caspase-3激活、PARP切割，以及Mcl-1表達的降低。
　　結(jié)論:
　　1.二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧-D-葡萄糖能