二甲雙胍及AICAR激活A(yù)MPK誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株P(guān)LC-PRF-5增殖抑制.pdf

1、背景及目的：腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase AMPK 屬于絲氨酸/氨酸激酶蛋白激酶，廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，是細(xì)胞能量調(diào)節(jié)的感受器，負(fù)責(zé)能量調(diào)節(jié)及傳遞。生理狀態(tài)下AMPK 不活躍，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)和能量耗竭使AMP/ATp比例升高時(shí)，AMPK 可被上游基因激活，使AMP/ATp比例恢復(fù)正常。近年來的研究資料表明AMPK 激活對(duì)腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，因此，能使AMPK 激活的藥物將有

2、可能成為抗腫瘤藥物的新選擇。LKB1/AMPK 途徑在正常組織具有抑制腫瘤細(xì)胞形成的作用，而在體外，也已被證明其對(duì)多數(shù)人類腫瘤細(xì)胞株具有毒性作用，其中包括肺癌，前列腺癌，胃癌，乳腺癌。而AMPK 對(duì)肝癌細(xì)胞是否也存在抑制作用，及其對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響，目前報(bào)道較少。
　　 二甲雙胍是雙胍類藥物的代表藥物，其降血糖作用的臨床應(yīng)用已有半個(gè)多世紀(jì)，在我國，二甲雙胍是2 型糖尿病的一線治療藥物。而近年來研究表明，二甲雙胍除了其降血糖作用

3、外，還具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的作用，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等。
　　 上述作用被證明是由二甲雙胍激活A(yù)MPK 所誘導(dǎo)，目前二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞是否具有生長(zhǎng)抑制作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究將通過二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5 增殖抑制、細(xì)胞周期的影響及其作用分子機(jī)制的研究，為AMPK 成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)以及二甲雙胍成為抗腫瘤藥物的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法
　　 1. 用含10%胎牛

4、血清，100U/ml 青霉素和100U/ml 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5 細(xì)胞及人宮頸癌細(xì)胞株HeLa 細(xì)胞；HeLa 細(xì)胞缺乏LKB1基因，而LKB1基因是AMPK 上游激酶，因此，實(shí)驗(yàn)中采用HeLa 細(xì)胞做為陰性對(duì)照。
　　 2. 用含10mM的二甲雙胍培養(yǎng)基和1000 μM的AICAR的培養(yǎng)基作用PLC/PRF/5 細(xì)胞15min，以未予藥物處理細(xì)胞為對(duì)照，Western Blot

5、檢測(cè)AMPK 磷酸化程度。
　　 3. 用含不同濃度二甲雙胍(2.5、5.0、10、20mM)，AICAR（200、500、1000、2000 μM ）的培養(yǎng)基分別處理PLC/PRF/5 細(xì)胞24、48、72h ；用含10mM的二甲雙胍培養(yǎng)基和1000 μM的AICAR的培養(yǎng)基分別處理HeLa 細(xì)胞24、48、72h，以未予藥物處理細(xì)胞作對(duì)照；噻唑藍(lán)比色法(MTT 法)檢測(cè)二甲雙胍及AICAR 對(duì)PLC/PRF/5 細(xì)胞及HeL

6、a 細(xì)胞增殖的影響。
　　 4. PLC/PRF/5 細(xì)胞用含10mM的二甲雙胍的培養(yǎng)基和1000 μM的AICAR的培養(yǎng)基作用72h，經(jīng)碘化丙啶（PI ）單染法，用流式細(xì)胞分析儀（FCM ）檢測(cè)PLC/PRF/5 細(xì)胞周期情況。
　　 5. PLC/PRF/5 細(xì)胞用含10mM的二甲雙胍的培養(yǎng)基和1000 μM的AICAR的培養(yǎng)基作用72h，DAPI染色觀察PLC/PRF/5 細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果

7、　　 1. Western Blot 結(jié)果顯示，經(jīng)二甲雙胍及AICAR 處理后，PLC/PRF/5 細(xì)胞AMPK 磷酸化程度較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。
　　 2. MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，二甲雙胍及AICAR 能明顯抑制PLC/PRF/5細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且呈濃度依賴性；而二甲雙胍及AICAR 對(duì)HeLa 細(xì)胞的生長(zhǎng)無抑制作用。
　　 3. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，PLC/PRF/5 細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍及AICAR 處理

8、24h后，細(xì)胞周期發(fā)生停滯，G0-G1 期，S 期，G2-M 期和對(duì)照組相比較，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4. DAPI染色觀察可見，PLC/PRF/5 細(xì)胞經(jīng)二甲雙胍及AICAR 處理24h后，鏡下可見部分PLC/PRF/5 細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 結(jié)論
　　 1. 二甲雙胍及AICAR 能夠使肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5 AMPK 激活。
　　 2. 二甲雙胍及AICAR 通過激活A(yù)MPK