二甲雙胍通過AMPK-mTOR信號通路抑制高糖誘導的人腎小球系膜細胞衰老.pdf

1、衰老可以被定義為“使人類逐漸趨向死亡的變化的集合”。這一觀點意味著有機體在生物體系統(tǒng)不可避免地存在著功能的衰退。腎臟老化是一個復雜的多因素過程，有研究表明慢性腎臟病(CKD)風險在60歲以上老年人可升高8倍以上且腎臟功能隨年齡逐漸降低。腎小球系膜細胞是腎小球內(nèi)功能非?；钴S的細胞，在腎小球損傷和修復過程中起重要作用。同時，細胞衰老是機體老化的重要組成部分，因此，對細胞衰老的研究是器官及整體衰老防治研究的基石。二甲雙胍(Metformin)

2、作為廣泛使用的針對2型糖尿病(T2DM)的重要治療藥物，其治療作用早已不再局限于降低血糖，多項研究證實其在包括癌癥、心血管疾病等多種衰老相關性疾病的應用中都取得了突破性的進展。但二甲雙胍對腎小球系膜細胞衰老干預的研究較少。已有研究證實二甲雙胍可以激活AMP活化蛋白激酶-AMPK，一種能量感受器，可感知ATP損耗時增高的AMP與ADP水平。AMPK活化的主要作用是關閉能量消耗進程及促進能量生成，維持能量平衡。而AMPK活化可通過刺激TSC

3、2(Serl345)磷酸化以間接地抑制mTOR（mTOR是一種絲氨酸，蘇氨酸激酶，參與組成兩種功能性多蛋白復合體:mTORC1和mTORC2）導致mTORC1信號減弱或通過刺激Raptor(Ser722和Ser792)發(fā)生磷酸化促進其對mTORC1的抑制作用，最終導致mTOR活性減低。大量研究證實，mTOR活性降低可延緩衰老，延長壽命。
　　目的：觀察二甲雙胍對高糖誘導的人腎小球系膜細胞衰老表型發(fā)揮怎樣的調(diào)節(jié)作用，以及是否通過AM

4、PK/mTOR信號通路實現(xiàn)。以期進一步為腎臟衰老防治藥物的開發(fā)提供新思路。
　　方法：⑴體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞(HGMCs)，待細胞融合度達70％-80％左右時，應用無血清人腎小球系膜細胞培養(yǎng)基MCM進行同步化。光鏡下觀察細胞形態(tài)、β-半乳糖苷酶染色法染色衰老細胞、Western Blot法檢測衰老相關指標P53、P21及AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的表達情況。⑵基于上述實驗得出HG對人腎小球系膜細胞AMPK-

5、mTOR信號通路抑制最強時間點A。不同濃度Met與HG共同作用A時間，CCK8排除細胞毒性影響，篩選出Met激活AMPK-mTOR通路最強濃度B。⑶體外培養(yǎng)HGMCs，待細胞融合度達70％-80％左右時，應用無血清人腎小球系膜細胞培養(yǎng)基MCM進行同步化。光鏡下觀察細胞形態(tài)、β-半乳糖苷酶染色衰老細胞及Western Blot法檢測衰老相關指標P53、P21及AMPK/mTOR通路的活化表達情況。
　　結(jié)果：①NG組細胞呈瘦長條梭形

6、、排列整齊、細胞邊界清楚，多數(shù)為單核;Man組隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞體積逐漸脹大、水腫，其中可見顆?；蚩张?，排列不整齊;與NG組相比，HG組細胞隨著培養(yǎng)時間的延長，胞核形態(tài)漸趨不規(guī)則、出現(xiàn)雙核甚至多核，體積增大，胞漿扁平，胞內(nèi)伴有顆?；蚩张?，排列不規(guī)則，邊界欠清晰。與NG組細胞β-半乳糖苷酶染色陽性率9.40±2.42％相比，HG組24、48、72h染色陽性率分別為22.7±2.0％、37.3±6.6％、66.34±5.2％，較NG組

7、升高有統(tǒng)計學差異，P＜0.05;而Man組染色陽性率10.60±5.22％較NG組無顯著差異。與NG組相比，HG組P53、P21表達均顯著增加，分別在HG12、24、48h及HG24、48h較NG組表達增高差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05;與NG組相比，HG組p-AMPK表達水平顯著減低，于HG24、48、72h較NG組下降均有統(tǒng)計學意義，P＜0.05且HG72h時p-AMPK降低最顯著;各組AMPKa表達無明顯改變;與NG組相比，HG組

8、P-mTOR、mTOR均表達增加，且趨勢一致，分別在HG12、24、48h及HG24h、48h較NG組升高有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。各檢測指標Man組與NG組相比差異均無統(tǒng)計學意義。②與HG組相比，HG+Met20.0mmol/l組CCK8OD450nm數(shù)值減低有統(tǒng)計學差異，P＜0.05; HG+Met1.0mmol/L組、HG+Met5.0mmol/L組、HG+Met10.0mmol/L組OD450nm與HG組比均無顯著性差異。We

9、stern Blot測得HG+Met5.0mmol/L組及HG+Met10.0mmol/L組與HG組相比p-AMPK表達增加有統(tǒng)計學意義，P＜0.05;其中，HG+Met10.0mmol/L組p-AMPK表達最高。綜上，HG+Met10.0mmol/L組為選定刺激濃度，刺激時間為72h。③NG組細胞呈瘦長條梭形、排列整齊、細胞邊界清楚，多數(shù)為單核;Man組，體積脹大，細胞水腫，其中可見顆?；蚩张荩帕胁徽R;與NG組相比，HG組細胞胞核

10、形態(tài)不規(guī)則、出現(xiàn)雙核甚至多核細胞，體積增大，胞漿扁平，胞內(nèi)伴有顆粒或空泡，排列不規(guī)則，邊界欠清晰;HG+Met10.0mmol/L組細胞形態(tài)更趨近于NG組，與HG組相比，細胞形態(tài)更瘦長，排列也更為規(guī)則，胞核以單核為主，界限清楚。與NG組β-半乳糖苷酶染色陽性率10.17±2.98％相比，HG組69.96±7.70％顯著升高，P＜0.05; Man組11.01±3.28％無顯著改變;與HG組比較，HG+Met10.0mmol/L組β-半乳

11、糖苷酶染色陽性率15.00±1.01％顯著降低(P＜0.05)。HG+Met10.0mmol/L組較HG組p-AMPK表達顯著增加，P-mTOR、mTOR顯著降低，P＜0.05;NG與Man組間差異均無統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：⑴高糖可誘導人腎小球系膜細胞衰老，且其誘導衰老作用與高滲作用無關。⑵AMPK/m-TOR信號通路活性降低參與了高糖誘導人腎小球系膜細胞衰老的過程。⑶二甲雙胍可通過激活AMPK、抑制m-TOR信號抑制高糖誘導的