抑制mTOR通過SIRT1途徑延緩腎小球系膜細(xì)胞衰老的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:能量代謝失衡與衰老密切相關(guān)，也是目前衰老研究的熱點(diǎn)。限制熱量攝入(CR)可延長很多物種的壽命，在低等生物中限制熱量通過Sir2延緩衰老，而在哺育動物中限制熱量主要通過SIRT1(Sir2的哺育動物同系物)途徑延緩衰老及與衰老相關(guān)疾病的發(fā)生。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一類進(jìn)化上非常保守的蛋白激酶家族也是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，mTOR的活化促進(jìn)mRNA翻譯的起始與延伸以及蛋白質(zhì)的生物合成，是控制細(xì)胞生長與增殖的中心環(huán)節(jié)。

2、mTOR與細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)。mTOR的活化上調(diào)很多消耗能量的生物過程，促進(jìn)線粒體的能量代謝，同時，抑制mTOR能降低線粒體的膜電位，氧消耗和ATP的合成能力。并且在低等生物中部分抑制TOR(roTOR低等生物同系物)功能能夠增加壽限，抑制TOR延緩衰老的作用機(jī)制與限制熱量相似。腎臟是人體內(nèi)能量代謝非?；钴S的器官之一，因此，能量代謝異常與腎臟衰老密切相關(guān)。腎臟衰老的病理學(xué)特征是腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化，其中，腎小球系膜細(xì)胞

3、功能異常在腎臟衰老過程中起關(guān)鍵作用。研究表明mTOR的活化與糖尿病腎病、梗阻性腎病腎臟肥大密切相關(guān)，抑制mTOR能夠抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖和肥大以及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，改善腎間質(zhì)纖維化，提示mTOR與衰老相關(guān)腎臟纖維化密切相關(guān)，并可能參與了腎小球系膜細(xì)胞衰老。另有研究顯示，SIRT1在腎小球系膜細(xì)胞的凋亡及腎小球疾病過程中也起重要作用，是腎臟的一種保護(hù)因子。因此，本研究以能量代謝為切入點(diǎn)，觀察mTOR和SIRT1在系膜細(xì)胞高糖應(yīng)激衰老和復(fù)

4、制性衰老過程中的表達(dá)變化，研究SIRT1對系膜細(xì)胞高糖應(yīng)激衰老和復(fù)制性衰老的影響，并進(jìn)一步深入研究抑制mTOR后對系膜細(xì)胞高糖應(yīng)激衰老和復(fù)制性衰老及SIRT1的表達(dá)與活性的影響，探討mTOR對糖尿病腎病和腎臟衰老的影響機(jī)制。 方法:取3月齡大鼠原代系膜細(xì)胞建立高糖應(yīng)激衰老模型，檢測高糖應(yīng)激衰老過程中mTOR和SIRT1的表達(dá)變化，為了明確SIRT1在大鼠系膜細(xì)胞衰老中的作用，采用siRNA技術(shù)和尼可酰胺抑制SIRT1的表達(dá)與活性

5、，并檢測衰老相關(guān)的表型改變，給予SIRT1的活化劑NAD和白黎蘆醇觀察其對系膜細(xì)胞高糖應(yīng)激衰老的影響；在系膜細(xì)胞高糖應(yīng)激衰老過程中給予不同劑量的雷帕霉素(rapamycin)部分抑制mTOR的活性后觀察其對高糖應(yīng)激衰老和SIRT1的表達(dá)與活性的影響。同時觀察不同劑量rapamycin部分抑制mTOR的活性后對大鼠原代系膜細(xì)胞復(fù)制性衰老和SIRT1的表達(dá)與活性的影響，檢測系膜細(xì)胞在體外傳代過程中與衰老相關(guān)的β-gal染色、細(xì)胞周期和大小、

6、周期負(fù)調(diào)蛋白(P21、P27及P53)、mTOR和SIRTl的mRNA和蛋白表達(dá)隨代齡增加的變化；比較對照組與不同濃度rapamycin組12代齡細(xì)胞的增殖能力、衰老相關(guān)的β-gal染色的陽性細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞周期和大小、周期負(fù)調(diào)蛋白(P21、P27及P53)和P-mTOR和SIRT1蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果: 在系膜細(xì)胞高糖應(yīng)激衰老過程中： ①mTOR的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，而SIRT1的蛋白表達(dá)下調(diào)，NAD/NADH

7、比值下降，SIRT1的酶活性降低； ②SIRT1的活化劑NAD和白黎蘆醇能夠延緩系膜細(xì)胞高糖應(yīng)激衰老； ③siRNA-SIRT1和尼可酰胺抑制SIRT1的表達(dá)與活性后能夠加速系膜細(xì)胞衰老； ④不同劑量的rapamycin部分抑制mTOR的活性后能夠延緩系膜細(xì)胞高糖應(yīng)激衰老，同時增加SIRT1的蛋白表達(dá)及NAD/NADH比值和SIRT1的酶活性。 在系膜細(xì)胞復(fù)制性衰老過程中： ①隨代齡增加(5～12

8、代)，衰老相關(guān)的β-gal染色的陽性細(xì)胞數(shù)增加、周期負(fù)調(diào)蛋白(P21、P27及P53)的表達(dá)量增加，同時mTOR的mRNA和蛋白表達(dá)增加，而SIRTl的mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，酶活性降低； ②各組12代齡比較，不同濃度rapamycin組P-mTOR蛋白表達(dá)下降，SIRT1的表達(dá)量和酶活性增加，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，衰老相關(guān)的β-gal染色的陽性細(xì)胞數(shù)增加、停滯于G1期的細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞肥大改善、周期負(fù)調(diào)蛋白(P21、P27及P53