Maresin1對高糖損傷腎小球系膜細胞的保護作用及機制.pdf

1、目的：糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN）是糖尿病特有而嚴重的微血管并發(fā)癥之一。其突出病理表現(xiàn)為腎小球系膜病變、細胞外基質(zhì)合成增多，最終導(dǎo)致腎小球硬化和間質(zhì)纖維化。DN的病因與發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。研究顯示,DN是一種低度炎癥性疾病,長期高血糖造成的代謝紊亂及血流動力學(xué)改變可觸發(fā)腎臟炎癥反應(yīng)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體在高血糖刺激下可被激活，活化Caspase-1促進白細胞

2、介素IL-1β成熟和分泌，產(chǎn)生強大的內(nèi)源性炎性反應(yīng)，介導(dǎo)DN發(fā)生及發(fā)展。而腎組織病變所致的上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）在DN早期纖維化進展中起重要作用，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）在DN腎臟中高表達，是EMT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是腎臟纖維化的重要標志之一。Maresin1是來源于n-3不飽和脂肪酸的脂蛋白，是抗

3、炎促消退介質(zhì)中的最新家族之一，研究已證實maresin1不僅有強大的抗炎作用，而且可通過抑制TGF-β1誘導(dǎo)產(chǎn)生EMT改善肺纖維化的進展。但是，目前maresin1對DN炎癥和纖維化的相關(guān)作用尚未見報道，故本實驗通過體外培養(yǎng)小鼠腎臟系膜細胞觀察maresin1對高糖刺激下小鼠系膜細胞的保護作用并探究其可能的作用機制。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)及分組：體外培養(yǎng)小鼠腎小球系膜細胞，以30mmol/L高糖作為刺激因素，mare

4、sin1作為保護劑干預(yù)高糖作用，分別設(shè)為以下6組：（1）正常對照組（normal control group，NC組）：培養(yǎng)基含5.6mmol/L葡萄糖；（2）滲透壓對照組（osmotic pressure group，OP組）：培養(yǎng)基含5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇（滲透壓約等于30mmol/L高糖組）；（3）高糖組（high glucose group，HG組）培養(yǎng)基含30mmol/L葡萄糖；（4）不同濃度ma

5、resin1+高糖組:1nmol/L maresin1+30mmol/L葡萄糖組（M1+HG組）、10nmol/L maresin1+30mmol/L葡萄糖組（M2+HG組）、100nmol/L maresin1+30 mmol/L葡萄糖組（M3+HG組）（5）maresin1+正常組：作用最明顯濃度的maresin1+培養(yǎng)基含5.6mmol/L葡萄糖（6）NAC+高糖組(NAC+HG組)：高糖組預(yù)先加入10μmol/L活性氧抑制劑NA

6、C工作液作為干預(yù)因素，了解活性氧在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞的作用。
　　2.檢測方法：(1).觀察maresin1對高糖損傷腎小球系膜細胞的抗炎作用：?30mmol/L高糖刺激腎系膜細胞，RT-PCR檢測不同時間點NLRP3、Caspase-1、IL-1β的mRNA表達;?不同濃度maresin1(1、10、100nmol/L)預(yù)先處理小鼠腎系膜細胞30min后，用30mmol/L高糖培養(yǎng)基刺激24h，用蛋白免疫印跡(Wester

7、n blotting)和RT-PCR檢測各組細胞NLRP3、Caspase-1、pro-Caspase-1、IL-1β、pro-IL-1β的蛋白及mRNA相對表達量，并用分光光度計和熒光顯微鏡觀察各組細胞中活性氧（ROS)水平;③選擇作用最明顯濃度的maresin1干預(yù)30mmol/L高糖刺激系膜細胞培養(yǎng)24小時，用Western blotting、RT-PCR和免疫熒光檢測各組細胞NLRP3、Caspase-1、pro-Caspase

8、-1、IL-1β、pro-IL-1β的蛋白及mRNA相對表達量。(2).觀察maresin1對高糖損傷腎系膜細胞的抗纖維化作用：①30mmol/L高糖刺激腎系膜細胞，RT-PCR和ELISA分別檢測不同時間點的轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1) mRNA和纖連蛋白（FN）表達水平;②不同濃度maresin1(1、10、100nmol/L)預(yù)先處理細胞30min后，用30mmol/L高糖培養(yǎng)基刺激48h, RT-PCR和ELISA法檢測TG

9、F-β1的mRNA和FN的表達水平;③選擇作用最明顯濃度的maresin1干預(yù)30mmol/L高糖刺激培養(yǎng)48小時，用RT-PCR和ELISA法檢測TGF-β1的mRNA和FN的表達。
　　3.統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS20.0進行數(shù)據(jù)分析，各組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用方差齊性檢驗，組間多重比較用LSD-t法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1

10、、與正常組相比，高糖組小鼠腎小球系膜細胞ROS水平明顯增加， NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA表達水平呈時間依賴性增加（P＜0.05）；同時，TGF-β1和FN表達水平也明顯上調(diào)(P＜0.05)，并于48h后變化達峰值；
　　2、與高糖組相比，maresin1呈濃度依賴性地抑制高糖誘導(dǎo)小鼠腎系膜細胞ROS的生成及NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白和mRNA表達,且呈濃度依賴性增加pro-Caspase

11、-1、pro-IL-1β蛋白表達(P＜0.05)；
　　3、maresin1干預(yù)高糖作用后TGF-β1 mRNA和FN水平表達均減少（P＜0.05），其表達隨maresin1預(yù)先加入的濃度呈現(xiàn)遞減趨勢。
　　結(jié)論：高糖刺激可增加小鼠腎小球系膜細胞ROS產(chǎn)生、NLRP3炎癥小體及纖維化因子TGF-β1及FN的表達,maresin1可抑制活性氧誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活和腎臟纖維化因子TGF-β1及FN的表達。Maresin1