黃芪甲苷對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　在體外,研究高糖誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞(Human Mesangial Cell,HMC)損傷作用及黃芪甲苷(Astragalosides IV,As-IV)對(duì)其的保護(hù)作用,探討糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)發(fā)病機(jī)制與As-IV防治DN可能的作用機(jī)制,從而為As-IV的臨床應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.將HMC培養(yǎng)于含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中,置于5%

2、CO2,37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2.將常規(guī)培養(yǎng)的HMC隨機(jī)分為9組:正常糖組(NG,5.5 mmol/L葡萄糖);滲透壓對(duì)照組(NG+MA,5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇);高糖組(HG,30 mmol/L葡萄糖);Tempol組(含100μmol/L Tempol高糖DMEM培養(yǎng)液);TGF-β阻斷劑SB431542組(含10μmol/L SB431542高糖DMEM培

3、養(yǎng)液);As-IV不同濃度干預(yù)組(分別為12.5,25,50,100μmol/L As-IV高糖DMEM培養(yǎng)液)。另設(shè)立正常糖組細(xì)胞,并用不同濃度(12.5,25,50,100μmol/L)As-IV進(jìn)行干預(yù)。各組細(xì)胞孵育48h后,用倒置顯微鏡觀察HMC生長(zhǎng)狀況,各組細(xì)胞增殖情況采用MTT比色法檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,選擇藥物最佳作用劑量,并排除滲透壓對(duì)細(xì)胞的影響。
　　3.根據(jù)MTT的檢測(cè)結(jié)果,將常規(guī)培養(yǎng)的HMC隨機(jī)分為7組:正常組

4、(NG),高糖組(HG),Tempol組(100μmol/L),SB431542組(10μmol/L SB431542),As-IV低,中,高劑量組(25,50,100μmol/L As-IV)。各干預(yù)因素處理48h后,采用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-linked immunosorbent assaym,ELISA)法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中 IV型膠原(collagen typeⅣ,ColⅣ)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix m

5、etalloproteinase-9,MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的含量。
　　4.采用二氫二氯熒光素(DCFH-DA)法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量。同時(shí)采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth fact

6、or-β1,TGF-β1)、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase4,NOX4)、TRPC6蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.鏡下觀察顯示,與正常組相比,高糖組HMC細(xì)胞體積變大,數(shù)量增多,細(xì)胞之間融合趨勢(shì)明顯,表明高糖對(duì)HMC具有損傷作用。Tempol、SB431542及不同濃度的As-IV對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大均有不同程度的抑制作用,表明As-IV對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

7、　　2.MTT結(jié)果顯示,與正常組相比,高糖組細(xì)胞顯著增殖(P<0.01)。Tempol、SB431542及不同濃度的As-IV(12.5,25,50,100μmol/L)對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制作用(P<0.01或P<0.05)。隨著As-IV藥物濃度的增加,其抑制作用也更為顯著。不同濃度的As-IV對(duì)正常組細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響,滲透壓對(duì)照組與正常組相比,細(xì)胞增殖無(wú)顯著性差異。
　　3.ELISA結(jié)果表明,與正常組相比

8、,高糖組細(xì)胞上清液中ColⅣ、TIMP-1、MMP-9含量上升,MMP-9/TIMP-1比值下降(P<0.01)。Tempol、SB431542及不同濃度的As-IV(25,50,100μmol/L)組均可改善高糖誘導(dǎo)上述細(xì)胞因子的異常分泌,其中As-IV用藥組呈濃度依賴性,表明As-IV對(duì)系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成與降解具有調(diào)控作用。
　　4.DCFH-DA結(jié)果顯示,與正常組相比,高糖組熒光背景較強(qiáng),表明高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS含量

9、顯著升高。Tempol、SB431542及不同濃度的As-IV(25,50,100μmol/L)組均能有效減弱細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度,降低HMC細(xì)胞內(nèi)ROS含量﹙P<0.01或P<0.05),表明As-IV可有效緩解高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。
　　5.Western blot結(jié)果顯示,與正常組相比,高糖組HMC內(nèi)TGF-β1、p-Smad2/3、NOX4蛋白表達(dá)量顯著上升,TRPC6蛋白表達(dá)量下降(P<0.01)。與高糖組相比,Tempol、S

10、B431542組細(xì)胞內(nèi)TGF-β1、p-Smad2/3、NOX4蛋白表達(dá)量顯著下降,TRPC6蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.01)。不同濃度的As-IV組均可改善高糖誘導(dǎo)以上蛋白的異常表達(dá)(P<0.01或P<0.05),其中100μmol/L濃度組效果最好。
　　結(jié)論:
　　As-IV對(duì)體外高糖培養(yǎng)的HMC具有保護(hù)作用,作用機(jī)制可能與其具有抑制細(xì)胞增殖、緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)、改善高糖誘導(dǎo) HMC細(xì)胞內(nèi)ColⅣ、MMP-9、TI