骨髓間充質干細胞對高糖誘導β細胞損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、目的:探討骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)對長期高糖損傷的β細胞的保護效應及其機制。
　　方法:體外實驗，大鼠胰島素瘤細胞(INS-1)在高糖(33.3 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)基中處理48小時，之后與BM-MSCs或大鼠成纖維細胞(208F)共培養(yǎng)12小時，再進行下列檢測:(1)由細胞計數(shù)試劑盒(CCK8)檢測INS-1細胞活性;(2)膜連蛋白Ⅴ/碘化丙啶(AnnexinⅤ/Propidium iodine)染色檢測細胞凋亡率

2、;(3)放射免疫法(RIA)檢測INS-1細胞的胰島素分泌情況;(4)免疫印記法(western blotting)檢測裂解的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase3)和兩種常用的自噬標記物的表達，分別為Beclin1及微管相關蛋白1輕鏈3(LC3);(5)綠色熒光蛋白標記的LC3(GFP-LC3)質粒轉染至INS-1細胞以量化自噬;(6)應用免疫熒光法及透射電鏡(TEM)分別檢測INS-1細胞形態(tài)學及超微結構的變化;

3、(7)應用流式細胞儀檢測INS-1細胞內線粒體膜電位(MMP)及活性氧(ROS)生成量的變化。另外，在體內實驗中，將BM-MSCs輸注到經高脂喂養(yǎng)及小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導的2型糖尿病大鼠中。監(jiān)測大鼠血糖、胰島素及C-肽水平的變化。通過組織學染色、免疫熒光法及透射電鏡觀察大鼠胰島及β細胞的形態(tài)學及超微結構的變化。
　　結果:長期處于高糖環(huán)境下的INS-1細胞，其細胞活性下降、細胞凋亡率增加、基礎胰島索分泌(BIS)與葡萄糖刺

4、激的胰島素分泌（GSIS）均受損。BM-MSCs共培養(yǎng)有效減輕了長期高糖造成的這些損傷，而208F細胞共培養(yǎng)則無明顯效應。與此同時，westernblotting檢測發(fā)現(xiàn)，在與BM-MSCs共培養(yǎng)的INS-1細胞中，Beclin1和LC3-Ⅱ的表達明顯增加。免疫熒光染色及透射電鏡觀察的結果也說明BM-MSCs促進了高糖環(huán)境下INS-1細胞中自噬體與自噬溶酶體的形成。但是，抑制自噬明顯削弱了BM-MSCs對長期高糖損傷的β細胞的保護效應，

5、這就意味著BM-MSCs在一定程度上是通過增強自噬改善了高糖環(huán)境下β細胞的功能與存活。而且，與僅受到高糖處理的INS-1細胞相比，BM-MSCs改善了高糖環(huán)境下INS-1細胞中線粒體的功能，具體表現(xiàn)為MMP的恢復及細胞內ROS水平的下降，這在很大程度上是由于自噬清除了受損的線粒體。體內實驗發(fā)現(xiàn)，輸注BM-MSCs不僅能降低2型糖尿病大鼠血糖，還促進了胰島及β細胞的修復。更重要的是，結果顯示輸注BM-MSCs使2型糖尿病大鼠胰島β細胞中溶

6、酶體相關酶蛋白2（LAMP2）表達增加、自噬體及自噬溶酶體形成增多，同時伴隨著β細胞凋亡減少及胰島素顆粒數(shù)量的增加。
　　結論:
　　(1)與BM-MSCs共培養(yǎng)后可增強INS-1細胞自噬，從而保護INS-1細胞免受長期高糖引起的損傷。
　　(2)輸注BM-MSCs亦可通過調節(jié)自噬促進2型糖尿病大鼠胰島β細胞的修復。本實驗對間充質干細胞的治療機制有了新的認識，也為臨床應用間充質干細胞治療2型糖尿病提供了重要的理論依據。