骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)脊髓損傷模型大鼠的修復(fù)作用研究.pdf

1、目的：應(yīng)用脊髓損傷模型打擊裝置制備大鼠脊髓損傷模型，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對(duì)其進(jìn)行治療，觀察大鼠損傷脊髓的修復(fù)情況，并通過BMSCs能向脊髓損傷處遷徙、抑制神經(jīng)元凋亡并向神經(jīng)元分化，來探討其修復(fù)脊髓損傷的作用機(jī)制。
　　研究方法:根據(jù)BMSCs的貼壁特性，體外分離純化BMSCs。通過鏡下觀察BMSCs形態(tài)學(xué)變化、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、MTT法檢測(cè)其生長(zhǎng)特性、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記鑒定所分離的BMSCs;

2、采用自制打擊設(shè)備，應(yīng)用改良的Allen動(dòng)物模型方法制備大鼠脊髓損傷模型;根據(jù)改良Tarlov行為功能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，觀察脊髓損傷模型大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，并在光鏡下觀察比較經(jīng)BMSCs治療以及未經(jīng)治療大鼠的組織病理學(xué)變化；激光共聚焦顯微鏡下觀察體外經(jīng)DAPI標(biāo)記的BMSCs通過大鼠尾靜脈注入后是否向脊髓損傷區(qū)遷徙；使用免疫組織化學(xué)方法，觀察經(jīng)BMSCs治療后，對(duì)損傷脊髓周圍組織中Bcl-2，Bax及caspase-3表達(dá)的影響。用激光共聚焦顯

3、微鏡觀察在體外經(jīng)BrdU標(biāo)記的BMSCs通過靜脈及局部注入后，BMSCs上神經(jīng)元特異性蛋白NSE的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：分離純化的BMSCs呈均一的成纖維細(xì)胞樣,細(xì)胞周期顯示91.95％的P3代細(xì)胞處于 G0～G1期,免疫組化結(jié)果為CD44陽性、CD34、CD45陰性,生長(zhǎng)曲線證實(shí)BMSCs具有非常旺盛的增殖活性。
　　2. BMSCs對(duì)脊髓損傷大鼠的治療作用：根據(jù)改良Tar

4、lov行為功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后15天，治療組的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分較模型組顯著增高。術(shù)后7、15、30天損傷區(qū)脊髓的病理切片顯示：治療組較空白對(duì)照組均有顯著恢復(fù)；
　　3. BMSCs向模型大鼠脊髓損傷區(qū)的遷徙激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后5天，在脊髓損傷組織血管內(nèi)出現(xiàn)少量熒光標(biāo)記的BMSCs,10天后有血管外彌散,15天后有廣泛彌散。對(duì)照組于5天、10天及15天均未見DAPI標(biāo)記的BMSCs。
　　4. BMSCs對(duì)神經(jīng)元

5、凋亡的抑制作用術(shù)后7天，治療2組（BMSCs局部移植組） bax、caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)少于對(duì)照2組（單純手術(shù)組），治療1組（BMSCs靜脈移植組）Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)多于對(duì)照2組；術(shù)后15天，治療1組bax以及治療2組caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)少于對(duì)照2組，治療1組及治療2組Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)多于對(duì)照2組；移植后30天，治療1組bax陽性細(xì)胞表達(dá)少于對(duì)照2組，治療1組、治療2組Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)多于對(duì)照2組。

6、r>　　5、BMSCs上神經(jīng)元特異性蛋白的表達(dá)情況：移植后15周，部分陽性標(biāo)記的細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)元特異性蛋白，約15.1％表達(dá)神經(jīng)元特異性蛋白NSE。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)體外成功分離純化并擴(kuò)增BMSCs;反復(fù)傳代后仍能保持其原有的形態(tài)特點(diǎn)和分化能力; BMSCs經(jīng)尾靜脈及損傷局部注入后，可促進(jìn)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，對(duì)大鼠脊髓損傷具有修復(fù)作用; BMSCs經(jīng)尾靜脈注入后，可向損傷組織遷徙; BMSCs可以通過抑制caspase-3，