GDNF基因轉染大鼠間充質干細胞修復脊髓神經(jīng)損傷的實驗研究.pdf

1、目的:探討大鼠源性胎盤來源間充質干細胞(PMSCs)和骨髓來源的間充質干細胞(BMSCs)的培養(yǎng)方法并進行鑒定，將膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)轉染PMSCs和BMSCs，并研究兩種細胞轉染后的生物學特性。比較轉染GDNF基因的胎盤間充質干細胞和骨髓間充質干細胞修復脊髓神經(jīng)損傷的療效。為將PMSCs應用于脊髓神經(jīng)損傷的修復提供實驗基礎。
　　方法:采用密度梯度離心的方法將PMSCs從SD大鼠的胎盤中分離出來，并在體外傳代、純

2、化、擴增，BMSCs從SD大鼠的股骨骨髓中分離出來進行培養(yǎng)。對比觀察兩種細胞的細胞形態(tài)。檢測細胞表面標志物CD29、CD90、CD34、CD45。以GDNF過表達慢病毒感染BMSCs和PMSCs，觀察觀察綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的表達情況。以MTT法檢測轉染GDNF基因的PMSCs與BMSCs的細胞活力，Western blot檢測轉染后GDNF在PMSCs和BMSCs中的表達。將64只

3、SD大鼠制備脊髓打擊傷模型，造模成功后隨機分為四組:A組為單純PMSCs組，B組為單純BMSCs組，C組為PMSCs轉染組，D組為BMSCs轉染組，使用微量注射器依次注射單純細胞A-B組細胞和轉染細胞組C-D。于手術后7、14、28天對大鼠進行BBB運動功能評分。于手術后7、14、28天行HE染色并鏡下觀察，采用免疫組織化學染色觀察NSE、GFAP、NF-200在脊髓內(nèi)的表達。
　　結果:大概30％的細胞在接種48-72小時后開始

4、貼壁。經(jīng)過4天的培養(yǎng)，PMSCs和BMSCs都呈長紡錘狀，隨后均以形態(tài)均勻的類似成纖維細胞樣集落生長。流式細胞術測定表明，PMSCs和BMSCs陽性高度表達CD29、CD90，不表達CD34、CD45，表明本研究分離培養(yǎng)所得PMSCs和BMSCs為間充質干細胞。MOI=100時，轉染12小時后，PMSCs和BMSCs顯著表達綠色熒光蛋白(GFP)。細胞形態(tài)完整，沒有明顯的細胞病變效應。MTT法顯示轉染后PMSCs和BMSCs在3-5天時

5、呈現(xiàn)對數(shù)生長，6-7天生長速度減緩。轉染3天后，轉染后PMSCs和BMSCs組細胞活力明顯高于未轉染PMSCs和BMSCs組。動物實驗術后1天，所有組實驗大鼠下肢癱瘓。7d后，A、B、C、D組大鼠的運動機能略有改善，部分實驗大鼠下肢有1-2個大關節(jié)能活動。14天后，C、D組大鼠下肢運動功能改善，部分實驗大鼠下肢大小關節(jié)活動較好，A組、B組下肢功能恢復緩慢。28天后，C、D大鼠下肢運動功能恢復明顯改善，部分實驗大鼠能用雙下肢支撐身體重量，

6、A、B組大鼠下肢有所恢復。術后1、2、4周。C和D組的BBB評分沒有顯著差異(P＞0.05)。C和D組的評分，與A組、B組相比有顯著性差異(P＜0.05)。HE染色觀察，C組和D組問沒有顯著性差異，C組D組和A組，B組有顯著性差異，C，D組明顯優(yōu)于A，B組。GFAP和NSE免疫組化染色結果顯示脊髓損傷區(qū)C、D組GFAP大量表達，表達強度明顯比A、B組高，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，C和D組間沒有顯著性差異(P＞0.05);NF-20

7、0免疫組化染色結果顯示脊髓損傷區(qū)C、D組NF-200陽性神經(jīng)纖維長度長于A、B組，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。C和D組間沒有顯著性差異(P＞0.05)。
　　結論:應用密度梯度離心法能夠從大鼠胎盤組織中培養(yǎng)出大量增值能力較強的成纖維樣細胞。流式細胞儀檢測顯示胎盤來源的間充質細胞和骨髓來源的間充質干細胞具有相似的干細胞表面標志。GDNF能夠成功轉染PMSCs和BMSCs，轉染后具有較高的細胞活性。PMSCs和BMSCs具有相似的