脊髓去細胞支架復(fù)合人臍血間充質(zhì)干細胞移植修復(fù)大鼠脊髓全橫斷損傷的實驗研究.pdf

1、脊髓損傷是一類中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴重的致殘性傷病，據(jù)報道，其年發(fā)生率為10.4～83/100萬，只有不到1%的患者能夠完全恢復(fù)，絕大多數(shù)患者均遺留部分或完全性癱瘓，其中82%是16～32歲的男性，給社會和家庭造成了不可估量的損失。受損脊髓經(jīng)歷了原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷的序貫過程，造成不同程度的細胞死亡、組織水腫、膠質(zhì)瘢痕形成和脊髓運動功能喪失。而死亡細胞裂解釋放的毒素又可導(dǎo)致?lián)p傷平面上下兩側(cè)的脊髓組織壞死，且病變壞死區(qū)的空洞形成、反應(yīng)性膠質(zhì)瘢痕

2、增生、以及軸突斷裂和脫髓鞘反應(yīng)，也對神經(jīng)細胞和軸突的再生產(chǎn)生抑制作用。多種治療SCI的方法已應(yīng)運而生，例如自體或同種異體細胞移植等，以補償或修復(fù)損傷區(qū)缺失的細胞。 但是，到目前為止，脊髓損傷的動物實驗尚沒有取得令人滿意的治療效果。其中主要原因之一是由于傳統(tǒng)的自體移植、同種異體移植或不同的合成支架移植都存在多方面的缺陷，例如，細胞來源受限、存在倫理學(xué)問題、免疫排斥反應(yīng)，以及人工支架不能模仿靶組織中細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和空間分布規(guī)律的結(jié)構(gòu)

3、限制等。如何才能克服這些神經(jīng)再生的不利因素呢？組織工程技術(shù)的快速發(fā)展為上述問題的解決帶來了希望。 本實驗組首次提出了脊髓去細胞支架的概念，希望通過摸索脊髓去細胞支架的制備方法，觀察脊髓內(nèi)基質(zhì)纖維的三維空間結(jié)構(gòu)，以研究脊髓去細胞支架與人臍血間充質(zhì)干細胞聯(lián)合移植對大鼠脊髓全橫斷損傷的治療效果。 目的： 1、制備脊髓去細胞支架，觀測脊髓內(nèi)基質(zhì)骨架的結(jié)構(gòu)特點； 2、改良人臍血間充質(zhì)干細胞的分離、體外培養(yǎng)和純化方法

4、，提高人臍血間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)的成功率； 3、將脊髓去細胞支架與人臍血間充質(zhì)干細胞體外共培養(yǎng)，觀測脊髓去細胞支架的細胞學(xué)相容性； 4、探索脊髓去細胞支架與人臍血間充質(zhì)干細胞聯(lián)合移植對大鼠脊髓全橫斷損傷的修復(fù)效果及相關(guān)機制。 方法： 1.制備脊髓去細胞支架： 1.1 取材：健康成年SD大鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（許可證號SCXK（粵）2006-0015），雌雄不限，體質(zhì)量195g～230

5、g。SD大鼠采用150g/L水合氯醛行腹腔過量麻醉（400mg/Kg）處死。在室溫和無菌條件下，經(jīng)左心室用生理鹽水灌注，直至右心耳流出液清亮為止。然后行大鼠后背正中切口，暴露并游離脊髓全長，隨機截取脊髓數(shù)段，每段長約2cm，分為A、B、C三個組。每組留1段作為正常對照，其余段均行化學(xué)萃取。每組取2段用于石蠟切片，2段用于掃描電鏡觀察。 1.2 脊髓的預(yù)處理和化學(xué)萃取分組：先在手術(shù)顯微鏡下剪去脊髓表面的脂肪組織和部分硬脊膜，然后進

6、行化學(xué)萃取。A、B、C三個組的萃取振蕩頻率分別為80r/min、120r/min和160r/min。將標本采用Triton X-100和脫氧膽酸鈉進行萃取，蒸餾水漂洗后行切片HE染色和掃描電鏡觀察。萃取后的脊髓置4℃無菌PBS溶液（0.01mol/L，pH7.4）中保存?zhèn)溆谩?2.人臍帶血的采集： 2.1 選擇健康足月產(chǎn)或早產(chǎn)婦，胎兒娩出后（胎盤仍在官腔內(nèi)），在距胎兒5cm～7cm處將臍帶雙重結(jié)扎，剪斷臍帶； 2

7、.2 消毒胎盤側(cè)臍帶斷端，穿刺臍靜脈，用無菌采血袋抽取20ml～120ml臍帶血（加肝素20U/ml抗凝）； 2.3 血袋置4℃冰箱保存，并于6h內(nèi)分離。 3.人臍血間充質(zhì)干細胞（hUCB-SCs）的分離、培養(yǎng)和純化： 3.1 采用四種方法分離人臍血單個核細胞：甲基纖維素沉降法（A組）、密度梯度離心分離法（B組）、甲基纖維素聯(lián)合密度梯度離心分離法（C組）、甲基纖維素聯(lián)合改良密度梯度離心分離法（D組）； 3

8、.1.1 甲基纖維素沉降法（A組）：臍血按1：1的體積比與5g/L甲基纖維素溶液混勻后，4℃靜置50min后分為兩層，下層為紅細胞，小心吸出含有血小板和有核細胞的上清，1500r/min離心20min，棄上清，加入5ml完全培養(yǎng)基，小心吹打，將混懸液再次離心5min后重懸，苔盼藍拒染法檢測細胞活力，用細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為6×109/L～7×109/L，接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，置于37℃、含

9、體積分數(shù)為0.05的CO2飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。 3.1.2 密度梯度離心分離法（B組）：按3：1的體積比將抗凝臍血小心疊加于相對密度1.077的Ficoll-Hypaque分離液上，1500r/min離心20min，液體分為4層，上層為含血小板的上清液，第2層為薄層單核細胞層，第3層為Ficoll-Hypaque液，第4層為紅細胞。小心吸取單核細胞層，加入5ml完全培養(yǎng)基，混勻后離心5min，棄除上層液體，加入5ml完全培養(yǎng)基

10、，小心吹打，將混懸液再次離心5min后重懸。然后同上述方法檢測細胞活力、計數(shù)和培養(yǎng)。 3.1.3 甲基纖維素聯(lián)合密度梯度離心分離法（C組）：C組在A組基礎(chǔ)上，將上層液體吸出并置于Ficoll-Hypaque分離液上，然后按照B組步驟進行操作。 3.1.4 甲基纖維素聯(lián)合改良密度梯度離心分離法（D組）：D組為在C組基礎(chǔ)上，將第2層單核細胞層吸出后，按體積比4：1，置于Ficoll-Hypaque分離液上，1500r/min

11、離心20min，吸出上面3層液體，小心吹打混勻，然后同上述方法檢測細胞活力、計數(shù)和培養(yǎng)。 4.hUCB-SCs的體外培養(yǎng)和純化 4.1 人臍血單個核細胞（MNCs）的活力鑒定：取一滴分離后的MNCs懸液滴于細胞計數(shù)板上，與0.5%的苔盼藍PBS溶液（pH7.4）按1：1體積比混合后加蓋玻片，1min后計數(shù)100個細胞?；罴毎麍A形透明，死細胞被染成藍色，用活細胞占記數(shù)細胞的百分比表示細胞活力。 4.2 hUCB-S

12、Cs細胞的傳代培養(yǎng)：各組細胞均在24h后首次全量換液，后每隔2d～3d全量換液一次。約7d～10d后，貼壁細胞融合至80%～90%時，加入0.2ml～0.3ml用2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA按1：1體積比配制的消化液，相差顯微鏡下觀察，當細胞發(fā)生形變時，終止消化，收集脫落細胞懸液，另置1瓶培養(yǎng)。以后當細胞再次融合至80%～90%時，同上述方法消化后，直接按1：2或1：3傳代培養(yǎng)。每次均在相差顯微鏡下進行細胞形態(tài)學(xué)觀察和照

13、相。 4.3 hUCB-SCs細胞核hoechst33258染色。 4.4 采用流式細胞儀鑒定hUCB-SCs的CD系列抗原表型。 5.將脊髓去細胞支架與人臍血間充質(zhì)干細胞體外共培養(yǎng)，了解支架的細胞學(xué)相容性及體外降解情況，并采用掃描電子顯微鏡觀察共培養(yǎng)復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)變化和植入細胞的存活、遷移和分布情況。 6.動物實驗：首先經(jīng)大鼠胸T9段脊髓全橫斷，建立急性全橫斷脊髓損傷大鼠模型。299只SD大鼠隨機分入

14、五組：A組為假手術(shù)對照組（僅行椎板切除，n=33）；B組為脊髓全橫斷對照組（脊髓全橫斷+PBS斷端注射，且分為B1和B2兩個亞組，B1組為普通常規(guī)操作組，n=57；B2組為顯微操作組，n=66）；C組為脊髓去細胞支架移植組（脊髓全橫斷+脊髓去細胞支架移植，n=38）；D組為hUCB-SCs移植組（脊髓全橫斷+hUCB-SCs移植，且分為D1和D2兩個亞組，D1組為普通常規(guī)操作組，n=29； D2組為顯微操作組，n=38；）；E組為脊髓去

15、細胞支架復(fù)合hUCB-SCs移植組（脊髓全橫斷+脊髓去細胞支架復(fù)合hUCB-SCs移植，n=38）。術(shù)后1w～12w，觀察大鼠后肢運動功能的恢復(fù)情況。 7.療效觀察：從術(shù)后第7天開始至術(shù)后第12w，采用BBB評分系統(tǒng)評分，并觀察和記錄大鼠后肢的關(guān)節(jié)運動、肢體協(xié)調(diào)等情況，觀測脊髓去細胞支架與hUCB-SCs聯(lián)合移植對脊髓全橫斷大鼠的治療效果。 8.組織取材和免疫組織化學(xué)染色：于術(shù)后第12w，采用過量麻醉處死大鼠，經(jīng)心臟行4

16、%多聚甲醛灌注固定后，取C1～T2及T7～T12段脊髓，行石蠟切片（片厚5μm）。切片經(jīng)1%BSA（用0.1 mol/L的PBS溶液稀釋）溶液封閉后，分別加入小鼠抗大鼠NSE和兔抗大鼠NF200單克隆抗體（1：200稀釋）孵育。PBS溶液漂洗后，加入適量的二抗（山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG，1：200稀釋）。鏡下觀察陽性細胞的形態(tài)和分布情況并拍照記錄。 9.經(jīng)坐骨神經(jīng)注入熒光金，逆行追蹤觀測脊髓長傳導(dǎo)束（皮質(zhì)脊髓束）的再生和突觸傳

17、導(dǎo)通路的重建，觀測脊髓神經(jīng)和突觸再生、神經(jīng)環(huán)路重建和實驗大鼠后肢神經(jīng)功能恢復(fù)情況，并探討其相關(guān)機制； 結(jié)論： 1、采用化學(xué)萃取方法可以成功制備大鼠脊髓去細胞支架；脊髓去細胞支架保存有天然的脊髓內(nèi)基質(zhì)纖維骨架，可更有效的引導(dǎo)神經(jīng)細胞和神經(jīng)纖維定向生長和定向遷移，并為神經(jīng)細胞彼此之間建立神經(jīng)聯(lián)系、以及神經(jīng)電沖動跳躍式傳導(dǎo)提供了支架結(jié)構(gòu)上的可能。 2、甲基纖維素沉降聯(lián)合改良的密度梯度離心分離法，可充分回收離心管貼壁細胞