人臍血單個(gè)核細(xì)胞聯(lián)合雪旺細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]：將從Wistar大鼠分離純化得到的雪旺細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并聯(lián)合根據(jù)Ficoll法分離得到的人臍血單個(gè)核細(xì)胞共移植治療脊髓損傷，探討聯(lián)合移植兩種細(xì)胞在治療脊髓損傷中的作用，評(píng)價(jià)該方法的療效。 [方法]：手術(shù)取大鼠雙側(cè)隱神經(jīng)，采用雙酶消化組織塊法結(jié)合機(jī)械分離法分離培養(yǎng)雪旺細(xì)胞；應(yīng)用反復(fù)組織塊培養(yǎng)法和差速貼壁法純化雪旺細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)規(guī)律并鑒定。利用MASCIS（Multicenter Animal Spinal Cord

2、Injury Study）Impactor ModelⅡ脊髓打擊器制成4組共40例Wistar大鼠T10脊髓損傷模型，每組10例：DMEM實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，人臍血單個(gè)核細(xì)胞（Human Cord Blood Mononuclear Cells，HCMNCs）移植組，大鼠雪旺細(xì)胞（Schwann Cells，SCs）移植組，HCMNCs與SCs聯(lián)合移植組。大鼠脊髓損傷造模術(shù)后1周，分別將DMEM、培養(yǎng)的SCs、以及根據(jù)Ficoll法分離得到的H

3、CMNCs分別按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行移植。術(shù)后3天開始至術(shù)后12周每周用BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)后肢恢復(fù)情況；術(shù)后12周，根據(jù)腳印分析實(shí)驗(yàn)，計(jì)算肢體旋轉(zhuǎn)角度和肢體間協(xié)調(diào)性；術(shù)后12周后每組隨機(jī)選擇3只動(dòng)物進(jìn)行10％BDA順行神經(jīng)示蹤標(biāo)記，標(biāo)記2周后處死動(dòng)物，取出動(dòng)物損傷段脊髓作5μm快速冰凍切片后，分別進(jìn)行BDA顯影熒光，免疫組化及HE染色。其中，4組實(shí)驗(yàn)大鼠BBB評(píng)分采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，比較不同時(shí)點(diǎn)指標(biāo)的變化趨勢(shì)；免疫組化染色的數(shù)字圖像經(jīng)I

4、mage pro plus5.0顯微圖像分析軟件處理，以綜合評(píng)估脊髓功能恢復(fù)程度。 [結(jié)果]：SCs經(jīng)分離純化后在體外穩(wěn)定傳4代，于鏡下觀察細(xì)胞清亮，呈兩端尖、中間膨大的長(zhǎng)梭形，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，經(jīng)S-100染色后呈綠色的雙極或多極梭形形態(tài)，胞核較亮，突起較暗。HCMNCs聯(lián)合SCs共移植治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)中，脊髓損傷后3周內(nèi)，各組功能改善的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；4周以后各組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），其中聯(lián)合移植組的實(shí)

5、驗(yàn)動(dòng)物BBB功能評(píng)分最高，單純SCs移植或HCMNCs移植的評(píng)分雖然高于空白對(duì)照組，但都低于聯(lián)合移植組。腳印分析實(shí)驗(yàn)中，肢體間協(xié)調(diào)性和肢體旋轉(zhuǎn)角度各組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01），聯(lián)合移植組改善亦顯著優(yōu)于其余3組。組織學(xué)觀察的結(jié)果均與功能學(xué)檢查的結(jié)果相吻合。HE和BDA染色發(fā)現(xiàn)聯(lián)合移植組損傷處空洞面積明顯小于其他組，且通過(guò)空洞的皮質(zhì)脊髓束纖維染色較多。NF-200免疫組化染色顯示聯(lián)合移植組免疫染色較對(duì)照組面積為大，且著色較深，

6、累積光密度（IOD）明顯高于對(duì)照組及單純HCMNCs移植組和SCs移植組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 [結(jié)論]：SCs可以分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并使脊髓損傷區(qū)域受損軸突再髓鞘化，從而促進(jìn)脊髓損傷后的軸突再生和功能恢復(fù)；HCMNCs在脊髓損傷區(qū)域可以向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，填充組織缺損，彌補(bǔ)脊髓空洞，有利于神經(jīng)再生軸突的延伸和突觸之間的連接。兩者聯(lián)合移植治療脊髓損傷后，利用SCs的優(yōu)勢(shì)促進(jìn)更多比例的HCM