臍血單個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)為肝樣細(xì)胞的研究.pdf

1、隨著胚層限制理論的打破，成體干細(xì)胞的可塑性已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。臍血干細(xì)胞以其干細(xì)胞含量高、來(lái)源豐富、采集簡(jiǎn)單、比較純凈等特點(diǎn)可能成為包括肝細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的較好來(lái)源。 目的；探討在細(xì)胞外基質(zhì)人血漿纖維連接蛋白的存在下，用成纖維細(xì)胞因子4(FGF-4)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)聯(lián)合誘導(dǎo)人臍血單個(gè)核細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的可行性。 方法：采集足月健康產(chǎn)婦臍帶血至含CPDA抗凝劑的無(wú)菌采血袋中，用等體積3％明膠沉淀紅細(xì)胞后采

2、用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，利用貼壁時(shí)間的差異去除成熟貼壁細(xì)胞，然后接種于DMEM低糖培養(yǎng)基，在用人血漿纖維連接蛋白包被過(guò)的培養(yǎng)板中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。分為誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組兩組，誘導(dǎo)組添加細(xì)胞因子HGF和FGF-4。在培養(yǎng)的第0、7、14、21、28天，分別以RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)分析甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、角蛋白18(CK-18)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)情況。并用糖原染色(PAS)方法檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞是否具有正

3、常成熟肝細(xì)胞合成糖原的功能。 結(jié)果：(1)倒置顯微鏡下觀察到的形態(tài)變化：誘導(dǎo)后細(xì)胞體積逐漸變大，形狀由圓形逐漸變?yōu)闄E圓形、不規(guī)則圓形、多邊形等，部分具有雙核多核呈現(xiàn)出典型的肝樣細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)。在細(xì)胞密度較高的區(qū)域有多個(gè)細(xì)胞聚集在一起的融合現(xiàn)象，這些高密度區(qū)域的細(xì)胞形態(tài)變化較低密度區(qū)更為明顯。(2)免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果：誘導(dǎo)后第7、14、21、28天ALB和CK-18染色均為陽(yáng)性著色；AFP染色在誘導(dǎo)第7、14天呈陽(yáng)性著色，第21

4、天陽(yáng)性著色細(xì)胞減少，到28天基本變?yōu)殛幮?。在未誘導(dǎo)組這些指標(biāo)均未見(jiàn)表達(dá)。(3)PAS染色結(jié)果：在第21天呈現(xiàn)弱陽(yáng)性著色，到第28天顯示強(qiáng)陽(yáng)性著色。無(wú)細(xì)胞因子組染色呈陰性。(4)RT-PCR結(jié)果：在誘導(dǎo)后7、14、21天未成熟肝細(xì)胞具有的表型AFP在轉(zhuǎn)錄水平有表達(dá)，到28天后即呈陰性表達(dá)。成熟肝細(xì)胞表型ALB和CK-18于誘導(dǎo)的第7天在轉(zhuǎn)錄水平就開(kāi)始表達(dá)，于誘導(dǎo)的第14天就有明顯表達(dá)并一直持續(xù)到檢測(cè)的第28天。 結(jié)論：聯(lián)合應(yīng)用HG