臍血干細(xì)胞體外分化為肝樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：在體外分別采用有細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系和無(wú)細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系，探討人臍血干細(xì)胞是否可以在體外培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，觀(guān)察肝細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，以期為治療肝臟疾病提供了新的細(xì)胞來(lái)源。 方法：常規(guī)無(wú)菌采集新鮮臍血，采用6％羥乙基淀粉、淋巴細(xì)胞分離液分離臍血(umbilical cord blood,UCB)的單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells,MNCs)。MNCs分組培養(yǎng)，對(duì)照組不加細(xì)胞因子，實(shí)驗(yàn)組加入重組人肝

2、細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growthfactor,HGF)、重組人成纖維生長(zhǎng)因子4(fibroblast growth factor-4，F(xiàn)GF-4)和重組人制瘤素(oncostatin M,OSM)，濃度分別為20gμg/L、10μG/L、10μg/L。并于誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的第7，14，21，28d采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)甲胎蛋白(alphafetoprotein,AFP)、細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK

3、l8)、白蛋白(albumin，ALB)和肝細(xì)胞抗原的表達(dá)，用PAS(periodic acid-schiff)法進(jìn)行糖原染色，流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)檢測(cè)細(xì)胞中ALB+表達(dá)，采用間接免疫熒光方法分析各組細(xì)胞ALB的表達(dá)情況，并用放射免疫法(radioimmunoassay，RIA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中AFP的分泌水平，分析是否誘導(dǎo)出肝細(xì)胞樣細(xì)胞。 結(jié)果： 1.實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)后7d的細(xì)胞免疫組化顯示AF

4、P染色陽(yáng)性，21d后基本為陰性；第14d檢測(cè)到CKl8、ALB呈陽(yáng)性表達(dá)，第21d檢測(cè)到肝細(xì)胞抗原表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性率逐漸增高。對(duì)照組免疫組化未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。 2.實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)第21d時(shí)檢測(cè)到糖原染色陽(yáng)性細(xì)胞，28d時(shí)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)照組培養(yǎng)的MNCs PAS染色呈陰性。 3.實(shí)驗(yàn)組FCM檢測(cè)顯示第7d幾乎未檢測(cè)到ALB+細(xì)胞，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ALB+細(xì)胞表達(dá)增加，呈上升趨勢(shì)；培養(yǎng)至第28d的ALB+細(xì)胞

5、達(dá)80％以上。對(duì)照組未檢測(cè)到ALB+細(xì)胞。 4.免疫熒光結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)14d后檢測(cè)到ALB陽(yáng)性表達(dá)，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，ALB仍呈陽(yáng)性表達(dá)；對(duì)照組未檢測(cè)到ALB的表達(dá)。 5.實(shí)驗(yàn)組砒A檢測(cè)結(jié)果表明第7dAFP水平最高，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐步下降趨勢(shì)；對(duì)照組在0，7，14，21，28d可檢測(cè)到低水平的AFP表達(dá)，其AFP值無(wú)明顯差異。 結(jié)論： 1.在無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的作用下，臍血干細(xì)胞不能夠分化為肝細(xì)胞