RA對臍血干細(xì)胞體外向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響.pdf

1、目的：研究RA對臍血干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的影響，探討臍血干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的條件．，從而為研究臍血干細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷提供實驗基礎(chǔ)。 方法：用密度梯度離心法從臍血中無菌分離單個核細(xì)胞(MNCs)置于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并在相同條件下擴(kuò)增、傳代，然后取體外擴(kuò)增5代的臍血MSCs，接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，在培養(yǎng)液中加入10ng/ml的bFGF，在37℃，5％CO<,2>條件下進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)24h，然后

2、吸去預(yù)誘導(dǎo)液，PBS洗滌3遍，加入含20％FBS的H-DMEM和20g/L的DMSO。在此基礎(chǔ)上加入不同濃度的RA作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，并根據(jù)誘導(dǎo)劑濃度的不同和誘導(dǎo)時間的不同分組，靜置培養(yǎng)觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)變化。分別于誘導(dǎo)24h、48h和72h后取細(xì)胞進(jìn)行免疫組化檢測神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)，神經(jīng)絲蛋白(NF-M)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)然后光鏡下隨機(jī)數(shù)取10個非重疊視野(×100)，計算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例結(jié)果用(x±s

3、)％表示，探討RA在不同時間點對臍血干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的影響。然后于誘導(dǎo)72h后分別取含1μmol/L、3μmol/L、5μmol/L RA的各組細(xì)胞進(jìn)行免疫組化檢測NSE、NF-M、GFAP的表達(dá)，光鏡下隨機(jī)數(shù)取10個非重疊視野(×100)，計算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，結(jié)果用(x±s)％表示，探討不同濃度的RA對臍血干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的影響。 結(jié)果：hMSC分離后體外培養(yǎng)約5d呈梭形變，培養(yǎng)15d～18d細(xì)胞達(dá)到

4、80％～90％融合。(1)光鏡下觀察MSC誘導(dǎo)為神經(jīng)元的形態(tài)變化：hMSC在預(yù)誘導(dǎo)液中處理24h后，梭形的臍血MSC胞體已發(fā)生收縮，細(xì)胞體積減小，部分胞體收縮成錐形或球形，細(xì)胞邊緣變得不規(guī)整。正式誘導(dǎo)后，胞體進(jìn)一步收縮，形成圓形、不規(guī)則的錐形、三角形，有的細(xì)胞有多個突起，而且發(fā)出分支，有的突起逐漸伸長，類似神經(jīng)元的長軸突，部分細(xì)胞拉成網(wǎng)狀，誘導(dǎo)72h后細(xì)胞的形態(tài)不再發(fā)生明顯的變化。(2)誘導(dǎo)后免疫組化檢測結(jié)果：不同誘導(dǎo)時間檢測顯示各實驗

5、組經(jīng)誘導(dǎo)后NSE陽性細(xì)胞的比例隨誘導(dǎo)時間的延長而不斷增高。誘導(dǎo)72h后各組NSE陽性率結(jié)果有顯著性差異(p<0.05)。用含不同濃度RA誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)時，隨RA濃度的增高NSE、NF-M及GFAP的陽性細(xì)胞的比例而不斷增高。誘導(dǎo)后免疫組化檢測，NSE、NF-M及GFAP的陽性細(xì)胞的比例結(jié)果有顯著性差異 (p<0.05)。 結(jié)論：RA對臍血MSC體外向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化有良好的促進(jìn)作用，是一種較安全的誘導(dǎo)劑。Imnol/L的RA能