人類胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)上皮細(xì)胞及多巴胺能神經(jīng)元的初步研究.pdf

1、第一部分人類胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)上皮細(xì)胞分化的兩種誘導(dǎo)體系的比較研究目的：1.比較兩種誘導(dǎo)體系下，hESCs向神經(jīng)上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率，以建立高效的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系；2.探討在兩種誘導(dǎo)體系下，hESCs向神經(jīng)分化過程是否都符合體內(nèi)早期神經(jīng)發(fā)育的規(guī)律。 方法：hESCs在人源性飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系下傳代培養(yǎng)。A組在飼養(yǎng)層細(xì)胞上直接誘導(dǎo)，B組經(jīng)類似EB的懸浮階段。16天后對兩個(gè)誘導(dǎo)體系在d0、d6、d10、d16的細(xì)胞行RT-PCR檢測多能性基

2、因，早期神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因，內(nèi)、中胚層基因，區(qū)域化基因的表達(dá)情況，及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測hESCs多能性標(biāo)記和神經(jīng)相關(guān)標(biāo)記的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.兩種誘導(dǎo)體系下，d10和d16均能夠產(chǎn)生大量Nestin和Musashi染色陽性的神經(jīng)上皮細(xì)胞；2.Pax6和Soxl陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示A組的神經(jīng)誘導(dǎo)效率高于B組；3.兩組細(xì)胞d10均為典型Pax6+Soxl-的Rosette結(jié)構(gòu)，d16均為Pax6+Soxl+的神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)；4.兩組細(xì)

3、胞基因表達(dá)趨勢相似，全能性基因的表達(dá)下調(diào)，神經(jīng)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)；5.A組細(xì)胞表達(dá)較高的前腦標(biāo)記，B組細(xì)胞表達(dá)較高的中后腦標(biāo)記。 第二部分神經(jīng)上皮細(xì)胞誘導(dǎo)為多巴胺能神經(jīng)元的研究 目的：1.建立神經(jīng)上皮細(xì)胞分化為DA能神經(jīng)元的誘導(dǎo)體系，為帕金森病的替代治療提供細(xì)胞來源；2.比較不同階段的上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化為DA能神經(jīng)元的差異。 方法：早期處理組和晚期處理組分別以d10天和d16的神經(jīng)上皮細(xì)胞為材料，用含100ng/ml

4、 FGF8和200 ng/ml SHH的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第22天，對照組采用不含SHH和FGF8的培養(yǎng)基，RT-PCR檢測中腦多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)基因En1和Nkx6.1的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測中腦多巴胺能神經(jīng)元特異性標(biāo)記TH的表達(dá)。 結(jié)果：1.d22時(shí)早期處理組細(xì)胞En1和Nkx6.1的表達(dá)明顯強(qiáng)于晚期處理組和空白對照組；2.早期處理組有大量TH+克隆，晚期處理組僅有少數(shù)TH+克隆。 第三部分帕金森大鼠模型的構(gòu)建目的：

5、構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的帕金森大鼠模型，為進(jìn)行細(xì)胞移植治療提供動(dòng)物模型。 方法：在大鼠腦立體定位儀上用4ug/ul 6-羥基多巴胺(6-OHDA)注射至成年SD大鼠右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束和黑質(zhì)致密部各2ul，然后應(yīng)用阿樸嗎啡(APO)誘發(fā)旋轉(zhuǎn)，進(jìn)行行為學(xué)觀察，并灌注、切片行酪氨酸經(jīng)化酶(TH)的免疫組織化學(xué)檢測。 結(jié)果：1.PD模型鼠出現(xiàn)典型的旋轉(zhuǎn)行為，10只中有5只旋轉(zhuǎn)速度超過210圈/30分鐘，在檢測的連續(xù)4周中，旋轉(zhuǎn)速度未見下降。

6、2.TH免疫組化染色見損毀側(cè)黑質(zhì)致密部的TH陽性細(xì)胞大部分丟失。 結(jié)論：1.建立了人源性的hESCs向神經(jīng)上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，直接誘導(dǎo)法比經(jīng)EB誘導(dǎo)法具有更高的誘導(dǎo)效率；2.體外進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)的過程都符合體內(nèi)的早期神經(jīng)發(fā)育過程；3.誘導(dǎo)第10天的神經(jīng)上皮細(xì)胞命運(yùn)還未限定，是進(jìn)一步誘導(dǎo)分化的起始作用時(shí)間點(diǎn)；4.在第10天的神經(jīng)上皮細(xì)胞中加入FGF8和SHH能夠誘導(dǎo)獲得中腦DA能神經(jīng)元；5.采用單側(cè)雙位點(diǎn)注射6-OHDA