人類胚胎干細胞體外誘導分化為神經(jīng)上皮細胞及多巴胺能神經(jīng)元的初步研究.pdf

1、第一部分人類胚胎干細胞向神經(jīng)上皮細胞分化的兩種誘導體系的比較研究目的：1.比較兩種誘導體系下，hESCs向神經(jīng)上皮細胞誘導分化的效率，以建立高效的誘導培養(yǎng)體系；2.探討在兩種誘導體系下，hESCs向神經(jīng)分化過程是否都符合體內早期神經(jīng)發(fā)育的規(guī)律。 方法：hESCs在人源性飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系下傳代培養(yǎng)。A組在飼養(yǎng)層細胞上直接誘導，B組經(jīng)類似EB的懸浮階段。16天后對兩個誘導體系在d0、d6、d10、d16的細胞行RT-PCR檢測多能性基

2、因，早期神經(jīng)發(fā)育相關基因，內、中胚層基因，區(qū)域化基因的表達情況，及免疫細胞化學檢測hESCs多能性標記和神經(jīng)相關標記的表達情況。 結果： 1.兩種誘導體系下，d10和d16均能夠產生大量Nestin和Musashi染色陽性的神經(jīng)上皮細胞；2.Pax6和Soxl陽性細胞計數(shù)結果顯示A組的神經(jīng)誘導效率高于B組；3.兩組細胞d10均為典型Pax6+Soxl-的Rosette結構，d16均為Pax6+Soxl+的神經(jīng)管樣結構；4.兩組細

3、胞基因表達趨勢相似，全能性基因的表達下調，神經(jīng)相關基因表達上調；5.A組細胞表達較高的前腦標記，B組細胞表達較高的中后腦標記。 第二部分神經(jīng)上皮細胞誘導為多巴胺能神經(jīng)元的研究 目的：1.建立神經(jīng)上皮細胞分化為DA能神經(jīng)元的誘導體系，為帕金森病的替代治療提供細胞來源；2.比較不同階段的上皮細胞誘導分化為DA能神經(jīng)元的差異。 方法：早期處理組和晚期處理組分別以d10天和d16的神經(jīng)上皮細胞為材料，用含100ng/ml

4、 FGF8和200 ng/ml SHH的誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第22天，對照組采用不含SHH和FGF8的培養(yǎng)基，RT-PCR檢測中腦多巴胺能神經(jīng)元相關基因En1和Nkx6.1的表達，免疫細胞化學檢測中腦多巴胺能神經(jīng)元特異性標記TH的表達。 結果：1.d22時早期處理組細胞En1和Nkx6.1的表達明顯強于晚期處理組和空白對照組；2.早期處理組有大量TH+克隆，晚期處理組僅有少數(shù)TH+克隆。 第三部分帕金森大鼠模型的構建目的：

5、構建穩(wěn)定、可靠的帕金森大鼠模型，為進行細胞移植治療提供動物模型。 方法：在大鼠腦立體定位儀上用4ug/ul 6-羥基多巴胺(6-OHDA)注射至成年SD大鼠右側內側前腦束和黑質致密部各2ul，然后應用阿樸嗎啡(APO)誘發(fā)旋轉，進行行為學觀察，并灌注、切片行酪氨酸經(jīng)化酶(TH)的免疫組織化學檢測。 結果：1.PD模型鼠出現(xiàn)典型的旋轉行為，10只中有5只旋轉速度超過210圈/30分鐘，在檢測的連續(xù)4周中，旋轉速度未見下降。

6、2.TH免疫組化染色見損毀側黑質致密部的TH陽性細胞大部分丟失。 結論：1.建立了人源性的hESCs向神經(jīng)上皮細胞誘導分化體系，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，直接誘導法比經(jīng)EB誘導法具有更高的誘導效率；2.體外進行神經(jīng)誘導的過程都符合體內的早期神經(jīng)發(fā)育過程；3.誘導第10天的神經(jīng)上皮細胞命運還未限定，是進一步誘導分化的起始作用時間點；4.在第10天的神經(jīng)上皮細胞中加入FGF8和SHH能夠誘導獲得中腦DA能神經(jīng)元；5.采用單側雙位點注射6-OHDA