人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)上皮祖細(xì)胞和多巴胺能神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hESCs)從植入前囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass,ICM)分離而來,具有多向分化潛能和無限自我更新能力,是細(xì)胞替代治療潛在的種子細(xì)胞來源,也為人類胚胎發(fā)育機(jī)制和基因功能研究及藥物篩選等提供了新的材料。神經(jīng)退行性病由于神經(jīng)細(xì)胞的缺失或死亡后機(jī)體無法再生出新的神經(jīng)細(xì)胞替代原有細(xì)胞的功能,如帕金森病、阿爾茨海默病和亨廷頓病等,發(fā)病率高,病程緩慢,臨床上尚無有

2、效的治療手段,hESCs來源的神經(jīng)細(xì)胞替代治療可能會(huì)為這些難治性疾病提供新的治療前景。
　　 hESCs作為種子細(xì)胞要發(fā)揮作用,首先要建立將其定向誘導(dǎo)分化為特定細(xì)胞的誘導(dǎo)方法,在體外高效地誘導(dǎo)產(chǎn)生高純度的特定神經(jīng)細(xì)胞,并具備相應(yīng)的生物學(xué)功能。目前,hESCs誘導(dǎo)為神經(jīng)上皮細(xì)胞和神經(jīng)元的方法各有千秋,但是相互之間缺乏系統(tǒng)比較。本研究采用本所建系的多株hESCs進(jìn)行體外誘導(dǎo),建立了一個(gè)簡單、高效、無血清、無動(dòng)物細(xì)胞污染的神經(jīng)上皮祖細(xì)

3、胞(neuroepithelial progenitors,NEP)和多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergic neurons,DAN)的誘導(dǎo)體系,為研究神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育機(jī)制和帕金森病細(xì)胞替代治療提供相應(yīng)的技術(shù)平臺(tái)和研究材料。
　　 論文第一章的研究內(nèi)容是建立簡單高效的hESCs向神經(jīng)上皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)體系,比較發(fā)現(xiàn)人胚胎成纖維細(xì)胞(human embryonicfibroblasts,HEF)誘導(dǎo)體系與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mou

4、se embryonicfibroblasts,MEF)體系一樣,可以在無血清培養(yǎng)條件下使hESCs直接貼壁誘導(dǎo),產(chǎn)生具有典型rosette結(jié)構(gòu)、表達(dá)Musashi,Nestin,Pax6等特異性抗原的NEP；且HEF體系的誘導(dǎo)效率更高。與懸浮誘導(dǎo)方法相比,直接貼壁誘導(dǎo)方法的效率更高。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加或不添加外源性的成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor2,FGF2),對(duì)于NEP的誘導(dǎo)效率沒有影響。采用無

5、飼養(yǎng)層(feeder free,FF)可直接誘導(dǎo)出表達(dá)Musashi,Nestin和Pax6的NEP,及34％表達(dá)SSEA4的細(xì)胞。HEF和FF誘導(dǎo)體系下骨形成蛋白(bone morphogeneticprotein,BMP)信號(hào)通路相關(guān)基因的檢測顯示,FF體系中BMP4高表達(dá),而HEF中幾無表達(dá),提示HEF體系低BMP信號(hào)通路活性更有利于NEP的誘導(dǎo)發(fā)生。
　　 論文第二章的研究內(nèi)容是建立HEF和FF體系產(chǎn)生的NEP的增殖擴(kuò)增

6、和向DAN誘導(dǎo)分化的體系。FGF2可以促進(jìn)神經(jīng)球和貼壁的NEP的增殖擴(kuò)增,且其促進(jìn)作用與FGF2呈濃度依賴性關(guān)系。NEP可在體外傳6代以上,并維持相應(yīng)NEP標(biāo)記及向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化的潛能。在區(qū)域特化因子成纖維細(xì)胞生長因子8(fibroblast growth factor8,FGF8)和音猬因子(sonic hedgehog,SHH)的作用下,NEP可誘導(dǎo)分化為表達(dá)Otx2和En1的中腦DAN前體,并進(jìn)一步分化為酪氨酸羥化酶(tyr

7、osine hydroxylase,TH)陽性的DAN。HEF和FF誘導(dǎo)分化終末階段的產(chǎn)生的Tuj1和TH陽性細(xì)胞間沒有差異,且沒有SSEA4陽性細(xì)胞殘留,說明兩種體系下產(chǎn)生DAN的效率相同。FF體系不依賴于飼養(yǎng)層細(xì)胞,有利于神經(jīng)發(fā)育生物學(xué)的研究及將來神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)體系的產(chǎn)業(yè)化。
　　 論文第三章的研究內(nèi)容是研究孤雌人胚胎干細(xì)胞(parthenogenetichuman embryonic stem cells,phESCs)向N

8、EP和DAN誘導(dǎo)分化的效率和安全性問題。和正常人胚胎干細(xì)胞(normal human embryonic stemcells,nhESCs)一樣,phESCs可產(chǎn)生的En1,TH和Tuj1陽性細(xì)胞,提示phESCs具備相同的向DAN分化的能力。NEP的比較染色體雜交檢測未發(fā)現(xiàn)基因組染色體拷貝數(shù)的改變。印記基因H19,IGF2和Snrpn表達(dá)的檢測發(fā)現(xiàn),NEP基本維持了印記基因的表達(dá)模式。由此認(rèn)為,phESCs具備向NEP和DAN分化的能