人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]：建立體外誘導(dǎo)人的胚胎干細(xì)胞(hESCs)分化為多巴胺能神經(jīng)元的條件，以期在培養(yǎng)系統(tǒng)中獲得更多的較純的、具有功能的多巴胺能神經(jīng)元，為細(xì)胞移植治療帕金森病的研究開(kāi)辟新的前景。 [方法]：將hESCs置于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，細(xì)胞接近融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行傳代，程序降溫法凍存，速溶方法復(fù)蘇，確定解凍后細(xì)胞復(fù)蘇率、克隆生長(zhǎng)與分化情況，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。 分三階段誘導(dǎo)hESCs定向生成神經(jīng)干細(xì)胞(NS

2、Cs)。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志；NSCs分化試驗(yàn)對(duì)所誘導(dǎo)的NSCs的分化潛能進(jìn)行檢測(cè)。 模擬體內(nèi)多巴胺神經(jīng)元分化發(fā)育的不同階段及微環(huán)境，采用早期添加音猥因子(SHH)及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-8(FGF8)的方法，誘導(dǎo)hESCs定向生成多巴胺能神經(jīng)元(A組)，并與傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方法(B組)相比較，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR法檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志，高效液相色譜法檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液

3、中多巴胺(DA)及其代謝產(chǎn)物高香草酸(HVA)的含量。 建立帕金森病(PD)大鼠模型，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組。利用立體定位技術(shù)將分化后的細(xì)胞移植到PD大鼠的紋狀體內(nèi)，對(duì)照組植入生理鹽水。免疫組化法證實(shí)移植細(xì)胞的存活并以誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為的改善來(lái)觀察其治療作用。 [結(jié)果]：hESCs穩(wěn)定增殖了5個(gè)月，傳代20代：細(xì)胞在MEF上呈集落生長(zhǎng)，細(xì)胞核大，核仁明顯。程序降溫法凍存后復(fù)蘇，細(xì)胞復(fù)蘇率達(dá)到78.3％；解凍后第12代細(xì)胞仍具有

4、穩(wěn)定的46XX核型；表達(dá)hESCs特異性蛋白及基因。 經(jīng)三步法最終可誘導(dǎo)形成純度高達(dá)90％以上的nestin陽(yáng)性細(xì)胞，表達(dá)nestin基因；所誘導(dǎo)生成的細(xì)胞反復(fù)傳代，仍表現(xiàn)為nestin陽(yáng)性，并可進(jìn)一步分化為神經(jīng)元、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。 誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)多巴胺能神經(jīng)元的特異性基因及蛋白。A組TH的陽(yáng)性表達(dá)率(73.68±4.71％)明顯高于B組(31.37±1.63％)；RF-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示A組TH、Nur

5、r1、Lmx1B表達(dá)量均高于B組；高效液相色譜方法檢測(cè)A組終止誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外DA、HVA含量均高于B組(P＜0.01，P＜0.05)。 移植前1-4周、移植后1-8周大鼠旋轉(zhuǎn)行為檢測(cè)結(jié)果：治療組由移植前289±60圈/30分鐘下降至229±37(P＜0.05)；而對(duì)照組移植前(290±47)，移植后(286±34)，臨床表現(xiàn)無(wú)改善(P＞0.05)。TH免疫組化染色顯示移植后治療組大鼠紋狀體內(nèi)存在著TH陽(yáng)性細(xì)胞，散在分布；而

6、對(duì)照組紋狀體內(nèi)未見(jiàn)TH陽(yáng)性細(xì)胞。 [結(jié)論]：成功建立了hESCs體外培養(yǎng)模式，為研究hESCs及相關(guān)疾病的防治提供細(xì)胞模型和細(xì)胞來(lái)源；三步誘導(dǎo)法可誘導(dǎo)hESCs生成較高純度的NSCs，并能較好維持其干細(xì)胞特性和具有進(jìn)一步分化的能力；SHH及FGF8早期聯(lián)合作用可高效的促進(jìn)hESCs分化為多巴胺能神經(jīng)元，且這些神經(jīng)元有分泌多巴胺的功能；誘導(dǎo)分化出的多巴胺能神經(jīng)元移植后，PD模型大鼠行為學(xué)明顯改善，對(duì)PD有一定的治療作用，為臨床治療