BMP2及ACM對SVZa神經(jīng)干細胞誘導分化為多巴胺能神經(jīng)元作用的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的： 神經(jīng)干細胞具有不斷增殖和自我更新能力，并可以分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞、少突膠質細胞，能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和神經(jīng)再生提供新的供體源，而且能較好地解決神經(jīng)移植治療的倫理道德及供體不足等問題，為神經(jīng)系統(tǒng)的許多疾病如帕金森氏病的治療帶來了新希望。 室管膜前下區(qū)(Anterior subventriculorzone，SVza)是公認的神經(jīng)干細胞富集區(qū)，該區(qū)的神經(jīng)干細胞在體內背一腹信號控制下，不斷沿著一條局

2、限化的遷移通道一吻側遷移流(Rostral migratory stream, RMS)向嗅球(Olfactory bulb, OB)遷移，最后在嗅球分化為具有OB表型特征的中間神經(jīng)元，包括：多巴胺能神經(jīng)元和γ-氨基丁酸能神經(jīng)元。并且SVZa神經(jīng)干細胞除具有一般干細胞的自我更新能力和多分化潛能外，還具有以下特點：(1)自產(chǎn)生起即具備發(fā)育為神經(jīng)元的潛能；(2)能長距離定向遷移；(3)在遷移過程中始終維持增殖狀態(tài)和神經(jīng)元分化潛能而不進一步分

3、化。故SVZa神經(jīng)干細胞成為研究神經(jīng)干細胞增殖、遷移和分化的最佳模型。 神經(jīng)干細胞的分化主要取決于兩個方面：一是干細胞的內在遺傳基因，二是干細胞所處的外部微環(huán)境。相同來源的干細胞處于不同的微環(huán)境中可以分化為不同類型不同譜系的細胞，因此目前對于干細胞分化的研究除了其自身基因的調控外，多側重于外來信號的調控。BMP2作為轉化生長因子-β(TGF-β)超家族成員，是干細胞所處局部微環(huán)境中非常重要的一種細胞因子。其在體外條件下對室管膜前

4、下區(qū)神經(jīng)干細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元作用如何還需要進一步的實驗研究。 另外，既往研究表明，單一因子誘導神經(jīng)干細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元作用非常有限，這就要求探求多種因子聯(lián)合作用從而使分化為多巴胺能神經(jīng)元比例增加。ACM作為星形膠質細胞體外培養(yǎng)時的細胞外液，其內含有膠質細胞分泌的豐富的可溶性生物活性物質，如：神經(jīng)生長因子(NGF)、膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)等，且與神經(jīng)干細胞所處的體內環(huán)境較為

5、接近，其促分化作用是單一神經(jīng)營養(yǎng)因子所無法比擬的。因此，本研究首先分離培養(yǎng)出SVZa神經(jīng)干細胞作為研究對象，然后再以不同濃度的BMP2誘導其分化，并分別檢測其分化為多巴胺能神經(jīng)元的比例。最后再以BMP2和ACM誘導SVZa神經(jīng)干細胞分化，研究它們在SVZa神經(jīng)干細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元中的作用，希望為SVZa神經(jīng)干細胞的定向分化研究提供一些實驗資料。 方法： 1、運用細胞培養(yǎng)技術對SVZa神經(jīng)干細胞進行分離培養(yǎng)，并將收獲

6、的細胞克隆球行免疫細胞學的Nestin鑒定，然后將細胞克隆球分化后行NF、GFAP、CNP的免疫細胞學鑒定，以明確其具有干細胞特性和多分化潛能。 2、將體外培養(yǎng)所得的SVZa神經(jīng)干細胞，分別以0、0．1、1、10、20、100(ng/ml)濃度的BMP2誘導其分化，通過免疫組化和流式細胞儀技術檢測不同濃度情況下SVZa神經(jīng)干細胞分化為TH+(酪氨酸羥化酶)神經(jīng)元的比例。 3、將體外培養(yǎng)所得的SVZa神經(jīng)干細胞，分為對照組

7、、BMP2組、ACM組、BMP2+ACM組分別予以誘導分化，通過免疫組化和流式細胞儀技術檢測各組中SVZa神經(jīng)干細胞分化為TH+細胞的比例。 結果： 1、在體外無血清培養(yǎng)條件下，可以收獲大量懸浮生長的細胞克隆球，Nestin免疫細胞學反應陽性，分化后的NF、GFAP、CNP免疫細胞學反應也呈陽性反應。 2、SVZa神經(jīng)干細胞分別以0、0．1、1、10、20、100(ng/ml)濃度的BMP2誘導分化后，經(jīng)檢測0．

8、1～100(ng/ml)組的TH+細胞比例均明顯高于0ng/ml組，10ng/ml組達最高峰，各組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。 3、SVZa神經(jīng)干細胞分為對照組、BMP2組、ACM組、BMP2+ACM組誘導分化后，免疫組化和流式細胞儀檢測結果提示：各實驗組的TH+細胞比例均明顯高于對照組，其中BMP2+ACM組分化比例最高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05) 結論： 1、從孕16天Wistar大鼠SVZa