甲狀腺激素對神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的調(diào)整作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：甲狀腺是多種職業(yè)有害因素?fù)p傷的主要靶器官之一。研究表明，妊娠期多種類型職業(yè)有害因素暴露均可導(dǎo)致機(jī)體甲狀腺激素(TH)缺乏，從而損傷子代神經(jīng)發(fā)育。TH是調(diào)控腦發(fā)育的必要激素之一，發(fā)育期間TH缺乏可導(dǎo)致突出生長、突觸形成、神經(jīng)元遷移、髓鞘形成等多種發(fā)育障礙。盡管既往針對TH對腦發(fā)育的影響研究較多，但大都集中在對TH在妊娠晚期及出生后功能的探討，而TH在胚胎早期發(fā)育過程中的作用，尤其是對胚胎神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells

2、, NSCs)的作用及機(jī)制未見文獻(xiàn)報道。文獻(xiàn)報道表明，TH在妊娠早期既已出現(xiàn)在胚胎腦內(nèi)，且甲狀腺激素受體(TR)在胚胎腦內(nèi)出現(xiàn)的時間比TH還早，提示TH-TR極有可能參與調(diào)控了早期腦的發(fā)育過程。基于以上認(rèn)識，本研究擬通過建立妊娠期甲減動物模型，探討妊娠期TH缺乏對胚胎腦神經(jīng)發(fā)生的影響及子代鼠成年后學(xué)習(xí)記憶功能的變化。并通過建立體外培養(yǎng)NSCs模型，探討TH對NSCs向神經(jīng)元分化的影響，并以TR及調(diào)控NSCs增殖分化的主要信號通路MAPK

3、(Erk1/2)、mTOR/Akt及JAK/STAT3為切入點(diǎn)探討其相應(yīng)的分子機(jī)制。
　　方法：
　　①取妊娠0天Balb/c孕鼠，以含PTU(500mg/L)的飲用水喂養(yǎng)至妊娠結(jié)束，并在妊娠第0d和第7d腹腔注射PTU(10mg/kg)，建立妊娠期甲狀腺功能減退的動物模型。
　?、谟贓13.5天時，采用Real time PCR檢測端腦Tuj1mRNA表達(dá)，于E16.5天時，采用免疫組化檢測胎鼠端腦新生神經(jīng)元數(shù)目，探

4、討PTU處理對胚胎鼠神經(jīng)發(fā)生的影響。
　?、鄄捎梅琶夥z測PTU處理第13d孕鼠及1M齡子代鼠血清TH水平；采用Morris水迷宮實驗檢測子代鼠2M齡時學(xué)習(xí)記憶功能。
　?、荏w外分離培養(yǎng)E13.5端腦NSCs，并采用生理濃度T3(0.3nM)處理NSCs，采用Neurosphere assay、CCK-8、TUNEL、Real time PCR及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測T3對NSCs維持、增殖、凋亡及分化的影響，以及分化神經(jīng)元突

5、出生長情況，探討T3對NSCs神經(jīng)元分化的作用。
　　⑤分別采用RT-PCR和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測在體及離體NSCs上TR mRNA及蛋白表達(dá)情況；并通過TRα1特異性siRNA干擾TRα1表達(dá)后，進(jìn)一步觀察T3對NSCs向神經(jīng)元分化的影響，以及對NSCs維持、增殖及凋亡的影響，探討TRα1在T3調(diào)控NSCs向神經(jīng)元分化中的作用。
　?、薏捎肳estern blot檢測T3對Erk1/2、Akt及STAT3蛋白表達(dá)及磷酸化

6、的影響，采用EMSA檢測T3對STAT3-DNA結(jié)合活性的影響，探討T3對STAT3信號通路活性的影響。
　?、卟捎肨Rα1特異性siRNA干擾其表達(dá)后觀察T3對STAT3信號通路活性的影響，探討TRα1在T3調(diào)控STAT3信號通路活性中的作用。
　?、嗖捎肧TAT3特異性抑制劑Stattic(5μＭ)處理NSCs后，觀察NSCs向神經(jīng)元分化情況，以及細(xì)胞維持及增殖情況，從而探討STAT3信號通路在調(diào)控NSCs向神經(jīng)元分化中

7、的作用。
　?、岵捎肧TAT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在NSCs上過表達(dá)STAT3，上調(diào)STAT3信號通路活性，進(jìn)一步觀察T3對NSCs向神經(jīng)元分化、細(xì)胞維持及增殖的影響，探討STAT3信號通路在T3調(diào)控NSCs向神經(jīng)元分化中的作用。
　　⑩采用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　?、偃焉锲赑TU處理13d后，孕鼠血清FT3及FT4水平明顯低于對照組；而子代鼠出生后1M齡時，血清FT3及FT4濃度無明顯改變；PTU

8、處理16.5d后，胎鼠端腦VZ/SVZ區(qū)Tuj1陽性細(xì)胞明顯少于對照組，且端腦Tuj1mRNA表達(dá)也顯著降低；子代鼠2M齡時，經(jīng)Morris水迷宮檢測，PTU組尋找平臺的潛伏期明顯長于對照組，而在目的象限搜索時間及穿越虛擬平臺的次數(shù)明顯少于對照組。
　?、谏頋舛萒3(0.3μＭ)處理NSCs6d后，NSCs向神經(jīng)元分化數(shù)目增多，Tuj1mRNA表達(dá)增高，并且分化神經(jīng)元突出總長度、一級分叉點(diǎn)數(shù)目及初級突出數(shù)目均較對照組增加；而向星

9、形膠質(zhì)細(xì)胞分化數(shù)目與GFAP mRNA表達(dá)減少；處理9d后，可見少突膠質(zhì)細(xì)胞分化數(shù)及CNPase mRNA表達(dá)明顯增高；同時第一代及第二代神經(jīng)球形成數(shù)目、Sox2mRNA表達(dá)與細(xì)胞增殖在T3處理后明顯降低，但TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目無明顯改變。
　?、跿Rα1mRNA及蛋白在E13.5離體培養(yǎng)及端腦NSCs上均存在表達(dá)，但TRβ不表達(dá)；通過TRα1特異性siRNA干擾TRα1表達(dá)后，再采用T3處理，發(fā)現(xiàn)T3對NSCs向神經(jīng)元分化及分

10、化神經(jīng)元突出生長的促進(jìn)作用，對星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的抑制作用，對細(xì)胞增殖和維持的抑制作用均有所逆轉(zhuǎn)。
　?、苌頋舛萒3處理1d、2d及3d后，Erk1/2與Akt蛋白表達(dá)及磷酸化均無明顯改變，而STAT3蛋白磷酸化顯著降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)STAT3-DNA結(jié)合活性在T3處理后也明顯降低；
　　⑤采用TRα1特異性siRNA干擾其表達(dá)后，再采用T3處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)T3對STAT3磷酸化以及對STAT3-DNA結(jié)合活性的抑制作用均顯

11、著減弱。
　　⑥采用STAT3特異性抑制劑Stattic(5μM)處理NSCs后，能夠誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化，抑制其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，且抑制NSCs維持與增殖。
　?、咄ㄟ^轉(zhuǎn)染STAT3質(zhì)粒在NSCs上過表達(dá)STAT3，上調(diào)STAT3信號通路活性后，再采用T3處理NSCs，發(fā)現(xiàn)T3對神經(jīng)元分化的促進(jìn)作用，以及對NSCs維持和增殖的抑制作用均有所逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論：
　　①妊娠期TH缺乏損傷成年海馬神經(jīng)發(fā)生，進(jìn)一步導(dǎo)致

12、學(xué)習(xí)記憶功能障礙。
　?、谏頋舛萒3促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化及分化神經(jīng)元突出生長，抑制其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，同時抑制NSCs維持與增殖。
　?、跿Rα1在E13.5離體培養(yǎng)及在體NSCs上均存在表達(dá)，且參與介導(dǎo)了T3對NSCs向神經(jīng)元分化的促進(jìn)作用。
　　④生理濃度T3處理抑制STAT3信號通路活性，且T3對STAT3信號通路的抑制作用需要TRα1介導(dǎo)。
　?、菀种芐TAT3信號通路活性可誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元分