miR-124a在小鼠內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元定向分化中的作用.pdf

1、感音神經(jīng)性耳聾足臨床常見病和多發(fā)病，嚴(yán)重影響人類健康及生活質(zhì)量，臨床上尚無理想的治療方法，目前關(guān)于感音神經(jīng)性聾的防治研究已成為臨床研究的熱點和難點之一。
　　 各種原因所致螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(spiral ganglion neurons,SGNs)的凋亡和變性是感音神經(jīng)性耳聾發(fā)生的主要病理機理。SGNs屬分化成熟的神經(jīng)細(xì)胞，易受直接/間接因素的影響而發(fā)生死亡(凋亡或壞死)。由于SGNs再生能力非常低，因此，受損SGNs的保護與再生

2、對恢復(fù)聽力可能起重要作用。干細(xì)胞因具有連續(xù)增殖能力及定向分化潛能，有可能成為神經(jīng)細(xì)胞損傷替代療法之一。目前的研究業(yè)已證明成熟的哺乳動物內(nèi)耳同樣存在神經(jīng)干細(xì)胞，只是處在不活躍狀態(tài)。如何促使不活躍的內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞重新進入細(xì)胞周期，并向特定的神經(jīng)元方向分化，是目前存在的關(guān)鍵問題。
　　 系列研究表明，控制干細(xì)胞增殖和分化的因素十分復(fù)雜，可能是多種因素共同作用的結(jié)果。microRNA(miRNA)是內(nèi)源性的大小在19～25bp的一類非蛋

3、白編碼RNA，通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)域(3'untranslated regions，3'-UTRs)結(jié)合，介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后抑制。人類基因組編碼的miRNA多達1000個，通過關(guān)鍵靶基因的負(fù)向調(diào)節(jié)，在發(fā)育、分化中發(fā)揮重要的作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，miR-132通過對靶基因cAMP效應(yīng)元件反應(yīng)結(jié)合蛋白(cAMP response elementbinding protein，CREB)的調(diào)控，抑制GTP酶激動蛋白p250GAP(sma

4、ll G proteinactive protein)的翻譯，從而調(diào)控神經(jīng)的生長。miR-134特異地表達于海馬，與神經(jīng)元的成熟有關(guān)，通過調(diào)節(jié)其靶基因Lim結(jié)構(gòu)域激酶1(LIM-domain kinase1，Limk1)mRNA，參與樹突及突觸形成。而miR-124a和miR-9特異地表達于神經(jīng)祖細(xì)胞，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal Transducer and Activator ofTranscription3，STAT3)的

5、磷酸化水平調(diào)節(jié)神經(jīng)元的分化，同時下調(diào)抑制元素1-沉默轉(zhuǎn)錄因子(Repressor Element-1-silencing transcription factor，REST)的表達水平以誘導(dǎo)非神經(jīng)基因的下調(diào)。Yu等的研究發(fā)現(xiàn)，P19小鼠胚胎瘤細(xì)胞中miR-124a表達水平與分化神經(jīng)元神經(jīng)突起的數(shù)量密切相關(guān)，這一研究還發(fā)現(xiàn)在皮質(zhì)神經(jīng)元中，沉默或過表達miR-124a對神經(jīng)元突起數(shù)量亦有明顯影響。由此可見，miRNA不僅在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化

6、中具有重要的作用，而且可能通過關(guān)鍵靶基因的負(fù)向調(diào)節(jié)，參與神經(jīng)細(xì)胞的自我更新或再生。
　　 由于海馬與聽覺系統(tǒng)存在內(nèi)在的聯(lián)系，因此我們設(shè)想：miRNA可能在內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元定向分化過程中同樣起重要作用。為了證實這一假說，我們利用文獻調(diào)查和生物信息學(xué)預(yù)測相結(jié)合，選取6個可能與內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞定向分化有關(guān)的miRNA為實驗內(nèi)容，通過實時定量PCR(Real-time quantitativePCR，qPCR)檢測其在內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞

7、定向分化過程中的表達水平，選擇其中表達差異最大的miR-124a為研究對象，觀察其在內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元定向分化過程中的作用。
　　 實驗一、新生小鼠內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立及定向誘導(dǎo)分化
　　 目的：建立新生小鼠內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞模型，探討其體外定向誘導(dǎo)分化的可能性。
　　 方法：
　　 1.分離新生一天小鼠蝸軸，消化、離心、洗滌、吹打、過濾、計數(shù)，接種于無血清培養(yǎng)液DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)，內(nèi)

8、含B27(1∶50)、N2(1：100)、20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF，置于5％CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)七天，形成從一個單細(xì)胞克隆擴增而成的實心球后，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物Nestin、Sox2，并且通過摻入BrdU的實驗，檢測實心球增殖活性。
　　 2.收集在增殖培養(yǎng)液中培養(yǎng)七天的實心球，接種于多聚賴氨酸和層粘連蛋白包被的蓋玻片上，分化培養(yǎng)液分化培養(yǎng)十四天，采用免疫熒光的方法，檢測神

9、經(jīng)元特異標(biāo)志TUJ1，觀察其分化特性。
　　 結(jié)果：
　　 1.新生小鼠蝸軸分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞由單細(xì)胞狀態(tài)不斷分裂增殖，形成懸浮的實心球。免疫熒光染色顯示，懸浮的實心球體多數(shù)細(xì)胞表達5-溴-2-脫氧尿嘧啶(5-bromo-2-demoxyuridine，BrdU)、細(xì)胞巢蛋白(Nestin)以及Sox2，說明懸浮的實心球具有神經(jīng)干細(xì)胞特征。
　　 2.誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元生長狀態(tài)好，突起交織成網(wǎng)，分化十四天達高峰，約

10、40％的細(xì)胞可分化為TUJ1表達陽性的神經(jīng)元。
　　 實驗二、 miR-124a在內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元定向分化中的作用
　　 目的：利用文獻調(diào)查和生物信息學(xué)預(yù)測相結(jié)合，選取6個可能與內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞定向分化有關(guān)的miRNA為實驗內(nèi)容，檢測這六個miRNA在內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元定向分化過程中的表達水平，選擇其中表達差異最大的miR-124a為研究對象，觀察其在內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞定向分化過程中的作用。
　　 方法：分離

11、培養(yǎng)新生小鼠的內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞七天形成干細(xì)胞球后，分別接種于多聚賴氨酸和層粘連蛋白包被的蓋玻片上貼壁分化三天和十四天，提取RNA，收集分子量小于200nt的小分子RNA，采用定量PCR方法(TagMan MiRNAAssays)，以snoRNA202做為內(nèi)對照，檢測6個miRNA在內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞定向分化不同時間點的表達水平，選取miR-124a作為研究對象，通過電轉(zhuǎn)染技術(shù)在內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞中沉默或過表達miR-124a，觀察其對內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)

12、胞定向分化及分化神經(jīng)元軸突生長的影響。
　　 結(jié)果：定量PCR顯示miR-124a在內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元定向分化過程中有顯著的差異性表達；電轉(zhuǎn)miR-124a mimics過表達miR-124a后，可促進內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化以及分化神經(jīng)元軸突的生長，電轉(zhuǎn)miR-124ainhibitor沉默miR-124a后對內(nèi)耳神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化以及分化神經(jīng)元軸突的生長有抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.