miR-124調(diào)節(jié)骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞在大鼠脊髓損傷中的治療作用.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injurey, SCI)這一嚴(yán)重致殘的重大傷病目前仍是世界性難題，其病理學(xué)基礎(chǔ)主要是直接或間接的損傷導(dǎo)致軸突變性和神經(jīng)元壞死。成人SCI后微環(huán)境的破壞致使中樞神經(jīng)再生困難。然而，由于SCI病理改變的復(fù)雜性，其治療效果一直欠佳，因此SCI及其修復(fù)機(jī)理是當(dāng)今世界神經(jīng)科學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)之一。為了征服這一疾病，眾多神經(jīng)科學(xué)工作者致力于此研究領(lǐng)域，希望通過研究、能找到緩解SCI給病人及家庭和社會(huì)帶來危害的有效方法。

2、目前，諸多團(tuán)隊(duì)在SCI修復(fù)的治療方法及機(jī)制研究方面做了大量工作，其中，神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)因其可以分化為神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞而倍受關(guān)注，而SCI后通過靜脈注射NSCs，可以在損傷灶發(fā)現(xiàn)移植的NSCs，并能分化為一定數(shù)量的神經(jīng)元跟膠質(zhì)細(xì)胞，使得NSCs被考慮可作為一種細(xì)胞替代療法的種子細(xì)胞進(jìn)行治療應(yīng)用研究，這也讓我們看到了讓SCI截癱病人恢復(fù)的希望。然而迄今為止，移植NSCs的有效性尚不理想，主要存在的問

3、題是，如果早期移植，容易因炎癥反應(yīng)而被體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬;如果移植較晚，則損傷灶容易形成瘢痕組織，影響神經(jīng)元的修復(fù)。有研究表明，在SCI后第7天移植NSCs效果較好，可能與該時(shí)期可避免巨噬細(xì)胞的吞噬、疤痕組織也未開始充分形成有關(guān)。為了更好地探討如何提高NSCs移植療效，本研究以大鼠SCI后的NSCs移植治療為研究理念、以microRNA為骨髓基質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)干細(xì)胞(BMSCs-D-NSCs)調(diào)控手段，進(jìn)行了microRNA調(diào)節(jié)NSCs向神經(jīng)

4、元方向分化、治療大鼠SCI的實(shí)驗(yàn)探討。
　　microRNA即小RNA，是一種存在于植物和動(dòng)物基因組里的小分子RNA，約20～24nt（少數(shù)小于20nt），由一段具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)、長度為70～80nt的單鏈RNA前體(Pre-miRNA)剪切后形成。它通過與其目標(biāo)mRNA分子的3，端非編碼區(qū)域(3'-untranslated region，3'UTR)完全或非完全互補(bǔ)匹配、參與基因轉(zhuǎn)錄后水平（蛋白表達(dá)）的調(diào)控，在生物體內(nèi)各種生理和病

5、理狀態(tài)都發(fā)揮著十分重要的作用。
　　miRNA最早由Lee等1993年在對線蟲(Caenothabditis elegans)胚胎發(fā)育研究過程中發(fā)現(xiàn)的一種具有調(diào)控功能的非編碼RNA。首先，miRNA基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Pri-miRNA)在細(xì)胞核中被RNaseⅢ Drosha切割成為前體miRNA(pre-miRNA)。在最初的剪切后，Pre-miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白exPortin-5的作用下、由核內(nèi)轉(zhuǎn)到胞質(zhì)中，然后由另一種RNas

6、eⅢ Dicer進(jìn)一步切割產(chǎn)生成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與其他蛋白質(zhì)一起組成RISC(RNA-inducedsileneing complex)復(fù)合體，從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制。
　　microRNAs具有重要的組織特異功能，在基因表達(dá)中發(fā)揮著總體調(diào)控作用，其中miR-124是神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)且最富含的microRNA。在雞胚神經(jīng)節(jié)，miR-124限制性地表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerve sy

7、stem，CNS）;在小鼠神經(jīng)中樞（大腦皮層，小腦和脊髓），miR-124濃集超過其它器官的100倍。但是，miR-124在CNS解剖區(qū)域上的表達(dá)存在明顯差異，在大腦皮層表達(dá)最多，小腦表達(dá)率是大腦皮層的60.7％，脊髓是35.4％。同時(shí)，miR-124在細(xì)胞增殖和分化過程的表達(dá)量也會(huì)發(fā)生變化。目前，對miR-124在CNS的表達(dá)研究更多局限在果蠅、小鼠和人類相關(guān)組織，而在大鼠等動(dòng)物中的研究還較少，但大鼠一般又被用來進(jìn)行SCI實(shí)驗(yàn)研究更適

8、宜。miR-124調(diào)控神經(jīng)元的細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、脊髓的發(fā)育等一系列重要生理活動(dòng)，作為神經(jīng)系統(tǒng)特異的microRNA，對神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷的調(diào)控機(jī)制尚未明了，尤其對SCI中的相關(guān)治療（如NSCs移植治療等）調(diào)控作用尚缺少文獻(xiàn)報(bào)道。本課題將探討miR-124調(diào)節(jié)NSCs在大鼠SCI中的移植治療作用。
　　第一部分:miR-124對BMSCs-D-NSCs的促分化作用
　　目的:將慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-cop

9、GFP進(jìn)行EcoRI/BamHI酶切，在基因庫中查詢miR-124序列5'-UAAGGCA CGCGGUGAAUGCC-3'，并進(jìn)行人工合成，利用PCR技術(shù)設(shè)計(jì)引物前鏈5'-GCCGATTC(EcoRI)CATCGCGTTCCCCAAA CCCC-3'與反義鏈引物5'-GCCGGATCC(BamHI)AGGGATGAAGGTG CTGGCCT，再用PCR擴(kuò)增microRNA Rno-miR-124，并在上游和下游引物分別添加限制性酶切位

10、點(diǎn)EcoRI和BamHI，將以上兩部分酶切連接后轉(zhuǎn)化到DH5-a內(nèi)。挑取陽性克隆，用PCR測序鑒定。構(gòu)建質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-mo-miR-124（其中GFP為報(bào)告基因），并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收取病毒上清液感染骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stroma cells，BMSCs)，并利用RT-PCR測定miR-124轉(zhuǎn)染BMSCs后及誘導(dǎo)成NSCs后的表達(dá)情況、進(jìn)一步觀察BMSCs-D-NSCs分化為

11、神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的情況。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均采用Mean±SD表示，Indepent samples t-test用來比較轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組NSCs分化為神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用SPSS17.0，P＜0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:BMSCs的轉(zhuǎn)染率可達(dá)90％以上，RT-PCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后BMSCs的miR-124表達(dá)量為轉(zhuǎn)染前的30-fold;經(jīng)過誘導(dǎo)成NSCs(BMSCs-D-NSCs)后

12、，轉(zhuǎn)染組NeuN陽性細(xì)胞的比例為53.60％±3.31％，未轉(zhuǎn)染組比例為34.40％±2.88％(p＜0.001);轉(zhuǎn)染組GFAP陽性細(xì)胞的比例為42.20％±1.62％，未轉(zhuǎn)染組為51.90％±3.03％(p＜0.001)。
　　結(jié)論:miR-124在體外可以促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化。
　　第二部分:miR-124調(diào)節(jié)BMSCs-D-NSCs對SCI治療作用
　　目的:將攜帶miR-124的BMSCs經(jīng)鼠尾靜脈注射，

13、治療SCI，觀察miR-124-BMSCs-D-NSCs治療效果。
　　方法:根據(jù)改良Allen's方法制作動(dòng)物模型。取90只成年Wistar大鼠、以氯胺酮(500mg/kg)腹腔注射麻醉，俯臥固定，以T10為中心縱行切口，顯露脊髓大小為3.0cm×0.4 cm的打擊區(qū)。以重20g、打擊頭直徑3mm的打擊器自10 cm高度自由落下，打擊勢能為2009.cm，打擊1次。次日見大鼠雙后肢完全松弛視為SCI建模成功。依實(shí)驗(yàn)條件將SCI模

14、型分為3組:第一組為術(shù)后未治療組，注射生理鹽水;第二組為正常移植組，注射BMSCs-D-NSCs;第三組為轉(zhuǎn)染移植組，注射miR-124-BMSCs-D-NSCs。取三組第1天，1周，2周及4周SCI的標(biāo)本，進(jìn)行HE染色，比較正常移植組與轉(zhuǎn)染移植組相對于損傷后未治療對照組空洞的變化。大鼠脊髓功能的恢復(fù)依據(jù)BBB評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均采用Mean±SD表示，Independent samples t-test

15、用以比較轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組與正常對照組之間的脊髓空洞變化。利用ANOVA中的LSD法，比較三組間BBB的差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用SPSS17.0，P＜0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:移植后14天，通過免疫熒光組織化學(xué)檢測法、對體內(nèi)移植細(xì)胞鑒定分析，發(fā)現(xiàn)病變部位有較明顯的miR-124-BMSCs-D-NSCs聚集（miR-124-BMSCs-D-NSCs由GFP所標(biāo)記），主要在受損脊髓的周邊（圖11A）。此外，共聚焦圖像顯示，有

16、較多表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物神經(jīng)元核蛋白(neuronnucleoprotein，NeuN)陽性的細(xì)胞（圖11B）和較少表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)的細(xì)胞（圖11C）出現(xiàn)在移植后14天。NeuN染色陽性細(xì)胞存活比率占16.0％±1.3％（Mean±SD），GFAP陽性細(xì)胞的成活率為13.95％±1.2％（Mean±SD）。損傷灶的大小在SCI后第28天，利用切

17、片進(jìn)行顯微測量計(jì)算。miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組與對照組相比，減少的脊髓組織損傷范圍、與單純NSCs移植組相對于對照組減少的脊髓組織損傷范圍，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，BMSCs-D-NSCs組相對于正常對照組、減小的體積為3.3％，轉(zhuǎn)染組相對于正常對照組、減少的體積為6.4％。
　　BBB評分
　　對以下三組動(dòng)物進(jìn)行BBB評分:未治療對照組（注射生理鹽水），單純NSCs移植組與miR-124-BM

18、SCs-D-NSCs移植組。每一周每組5只大鼠，觀察1～6周(n=90)，比較每一周內(nèi)三組之間BBB評分的關(guān)系。第1周，三組之間BBB評分無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.804)。第2周，單純BMSCs-D-NSCs移植組與損傷后未治療對照組BBB評分有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(9.20±0.84 vs.7.8±0.84，P=0.017)，損傷后未治療對照組與miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組之間的BBB評分有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(7.8±0.8

19、4 vs.9.20±0.71，P=0.035)，單純BMSCs-D-NSCs移植組與miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(9.20±0.84 vs.9.20±0.71，P=0.698)。第3周，單純BMSCs-D-NSCs移植組與損傷后未治療對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(10.60±1.14 vs.8.80±0.45，P=0.006)，miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組與損傷后未治療對照組亦有顯著統(tǒng)計(jì)

20、學(xué)差異(11.20±0.84 vs.8.80±0.45，P=0.001)，但是單純BMSCs-D-NSCs組與miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(10.60±1.14 vs.11.20±0.84，P=0.290)。第4周，單純BMSCs-D-NSCs移植組與損傷后未治療對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(11.40±1.14 vs.9.80±0.48，P=0.007)，miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組與單純

21、BMSCs-D-NSCs移植組之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(13.40±0.55 vs.11.40±1.14，P=0.002)，miR-124-BMSCs-D-NSCs移植組與損傷后未治療對照組之間也有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(13.40±0.55 vs.9.80±0.48，P＜0.001)。第5周，三組之間兩兩比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。第6周，三組之間的兩兩比較亦均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)（表2）。
　　結(jié)論:經(jīng)miR-